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    博迅對滇重樓幼苗生長發育及甾體皂苷含量的影

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-10-30 10:41【

    滇重樓 Paris polyphylla Sm. var. yunnanensis (Fr.) H. M. 為百合科重樓屬 Paris L. 植物,主要分布于貴 州、云南和四川等地區,是《中國藥典》2015 年版收 載的重樓藥材的基原植物之一,其干燥根莖入藥,具 有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效,是“云 南白藥”“宮血寧膠囊”等多種中成藥的主要原料, 市場需求量較大。市場上的重樓藥材多年以來主要依 賴于野生采挖,導致野生滇重樓藥材幾近枯竭,尋 求合適的栽培馴化滇重樓的方式迫在眉睫。

    1 材料與試劑

    2012 年 10 月,滇重樓 2 年生育苗的鮮種采自 云南省大理州農業科學院種植基地;2013 年 10 月, 滇重樓 1 年生實生苗和育苗栽培種源的鮮種采自貴 州省種植基地,滇重樓育苗野生種源的鮮種采自貴 州省野生環境,常溫下河沙貯存 4 個月,并經三峽 庫區道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗 室(重慶三峽學院)周濃教授鑒定為百合科植物滇 重樓 Paris polyphylla Sm. var. yunnanensis (Fr.) H. M. 的成熟種子,種子采用單株保存、保證種質資 源的穩定性和均一性。

    1.1 AM 真菌

    通過美國國際叢枝菌根真菌種質資源保藏中心 購得相應的 AM 真菌純凈菌劑,其菌劑由三峽庫區道 地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室(重慶三 峽學院)進行擴增繁殖、儲存保管。接種菌劑為帶有 孢子、菌絲及侵染后根段的栽培基質,見表 1。

    1.2 試藥

    對照品重樓皂苷 I(批號 111590-201103)、重 樓皂苷 II(批號 111591-201103)、重樓皂苷 VI(批 號 111592-201103 )、 重 樓 皂 苷 VII (批號 111593-200402)購自中國食品藥品檢定研究院,質 量分數均大于 98%。乙腈(德國默克公司,色譜純), 水(娃哈哈純凈水)。

    1.3 儀器

    DZF-6050MBE 型電熱恒溫真空干燥箱(上海博訊實業有限公司);CP225D 型分析天平(德國 Sartorius 公司);TDZ5-WS 型多管架自動平衡離心 機(湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司); SB-5200DTN 型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技 股份有限公司);LC-20A 型高效液相色譜儀、 UV2450 型紫外可見分光光度計(日本島津集團)。

    2 方法

    2.1 實驗設計

    種子前處理,去除外果皮,用蒸餾水洗凈,10% NaClO 溶液浸泡 15 min 后用蒸餾水洗凈,備用; 紫云英種子用 10% NaClO 溶液浸泡 15 min 后用蒸 餾水洗凈,備用。育苗栽培基質為菜園土與河沙的 混合物(體積比 3∶1,過 2 mm 篩,121 ℃高壓 滅菌鍋內滅菌 2 h)。2013 年 1 月、2014 年 1 月分 別將滇重樓 2 年生、1 年生實生苗育苗,采用室內 常溫栽培法,設置 9 個處理組(AM 真菌組,S1~ S9)和 1 個對照組(CK 組,S10)共 10 組,每組 重復 10 次,每盆接種 180 個孢子的混合菌劑(均 分),與紫云英混合播種培養,待滇重樓種子出土 后除去紫云英植株,每盆間苗 20 株。滇重樓栽培 種源及野生種源新鮮種子于 2014 年 01 月與 AM 真菌混合共生育苗,采用室內常溫栽培方法,設置 9 個處理組(AM 真菌組,S1~S9)和 1 個對照組 (CK 組,S10)共 10 組,每組重復 10 次,每盆接 種 180 個孢子的混合菌劑(均分),與紫云英混合 播種培養,待滇重樓種子出土后除去紫云英植株, 每盆間苗 20 株。滇重樓幼苗生長期間定期澆 Hoagland 營養液。 于 2015 年 6 月,采集栽培種源滇重樓育苗(T1) 和 1 年生滇重樓實生苗(T5)待測滇重樓樣品,于 2015 年 7 月,采集 1 年生滇重樓實生苗(T6)待測 滇重樓樣品,于 2015 年 8 月,采集栽培種源滇重樓 育苗家種(T2)、野生種源滇重樓育苗野生(T4)、1 年生滇重樓實生苗(T7)和 2 年生滇重樓實生苗(T8)待測滇重樓樣品,于 2016 年 8 月,采集種子栽培種 源滇重樓育苗(T3)待測滇重樓樣品。收獲滇重樓的 根莖、根系,洗凈后置于 35 ℃烘箱烘干,用于品質 分析;在冰水浴中洗凈根系,剪成 1.0~1.5 cm 長的 根段,一部分置于福爾馬林-醋酸-70%乙醇(FAA) 固定液中固定后用于菌根侵染率的測定。

    2.2 AM 真菌的侵染率

    隨機選取浸泡于 FAA 固定液中滇重樓根系 30 條,采用 Philips 等的方法染色、制片、鏡檢,根 據 Trouvelot 等的方法統計菌根侵染率。

    2.3 滇重樓幼苗葉片光合色素含量及生理指標的測定

    根據張志良等的方法對滇重樓幼苗光合色 素含量測定;過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分 光光度法測定;過氧化物酶(POD)活性采用愈創 木酚顯色法測定;超氧化物歧化酶(SOD)活性采 用氮藍四唑法測定;丙二醛(MDA)和可溶性糖含 量采用硫代巴比妥酸法測定;可溶性蛋白含量采用 考馬斯亮藍比色法測定。

    2.4 滇重樓幼苗生物量的測定

    采收滇重樓后,測定各處理組新鮮根莖質量 后,分別置于 35 ℃烘箱中干燥至恒定質量,測定 不同處理組干質量,計算其折干率。

    2.5 不同接種時期滇重樓幼苗根莖中重樓皂苷含量測定

    采用《中國藥典》2015 年版重樓藥材項下測定 4 種重樓皂苷的含量。

    2.6 數據分析

    采用Microsoft Excel 2003軟件作圖,運用SPSS 20.0 進行統計分析。

    3 結果與分析

    不同接種時期滇重樓幼苗根系均 在一定程度上受到了 AM 真菌的侵染,除 CK 組未 被侵染外,其他處理組的侵染率在 91.29%~ 100.00%,各實驗組均無顯著性差異(P>0.05), 這與周濃等的研究結果一致。而在自然條件下, AM 真菌的侵染率為 36.41%~83.7%。綜上可知, 接種外源AM 真菌對滇重樓根系菌根侵染率具有一 定的促進作用,說明通過外源接種 AM 真菌以提高 滇重樓的品質具有可行性。與 CK 組相比,不同接種時期滇重樓 3 種保護酶 CAT、POD 和 SOD 的活性有不同 程度的提高。其中,T1、T5 時期的 POD 與 SOD 活 性提高更為顯著。在不同的處理組中,S6、S8、S9 的 3 種酶活性提高更為明顯。3 種保護酶的活性表 現為 POD>SOD>CAT,可能是因為 POD 活性對 環境變化表現的更為敏感。表明接種 AM 真菌有利 于滇重樓葉片保護酶活性提高。

    4 討論

    研究結果表明,各處理組均能與 AM 真菌形成 一定的共生關系,但各處理組對滇重樓生長發育情 況的影響程度存在差異。與 CK 組相比,菌根化滇重樓的侵染率良好,即 AM 真菌與滇重樓幼苗 根莖形成了菌根,說明通過引入外源叢枝菌根真菌 可提高滇重樓幼苗的生活力。接種 AM 真菌有助 于光合色素含量的提高,進而促進滇重樓的生長發 育。現有研究表明,AM 真菌能激活植物對多種生 物或非生物脅迫的防御機制,從而提高植物的抗逆 性,包括對病蟲害、重金屬污染、鹽害、干旱等脅 迫的抗性。CAT、POD 和 SOD 作為植物體內清 除自由基的關鍵保護酶,能起到清除活性氧、維持 氧代謝平衡的重要作用。與 CK 組相比,不同接 種時期滇重樓的 3 種保護酶活性均大于對照組,說 明接種 AM 真菌增強了植株對不利環境的抗性。 植株體內的滲透調節物質包括可溶性糖、可溶性蛋 白,其能幫助維系植物細胞內的膨壓進而利于增強 植株的抗逆性。與對照組相比,滇重樓葉片的可溶 性糖的含量均有明顯的增加,但可溶性蛋白變化不 明顯。細胞膜系統的損傷是植物水分脅迫的重要原 因,葉片中 MDA 含量的增多與膜相對透性呈顯著 正相關。各接種時期的 MDA 含量均低于對照 組,表明接種 AM 真菌的各處理組降低了受逆境 環境的脅迫程度。

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