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    博迅分析五步蛇蛇毒的體外抑菌作用

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-10-25 10:23【

    抗生素的發現為人類對抗感染性疾病做出了巨 大的貢獻。但是近些年來隨著人們對抗生素的不 合理使用 甚 至 濫 用,直接導致大量耐藥菌的產生, 常規的抗菌藥物對于治療常見的細菌感染也愈發困難。蛇毒是從毒蛇腺體中分泌的一種液體,主要 成分為一些活性酶類、多肽及蛋白質,占毒液干重 90%~95%,還含有部分脂肪、碳 水 化 合 物、金 屬 離子、核 苷、胺類以及游離氨基酸等。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料與試劑

    1.1.1 實驗菌株

    金黃色葡萄球菌 (Staphylococ- cusaureus,CMCC26003)、甲型溶血性鏈球菌 [α- Hemolyticstreptococcus,CMCC (B)32213]、 枯 草芽胞 桿 菌 (Bacillussubtilis,CMCC63501) 和 大腸埃希菌 (Escherichiacoli,CMC44113),以上 菌株均由廣西醫科大學微生物學教研室提供 (購自 中國食品藥品檢定研究院)。

    1.1.2 實驗藥品與試劑

    廣西眼鏡蛇和五步蛇蛇毒 由廣西醫科大學蛇毒研究所提供,銀環蛇蛇毒購自 義烏市蛇毒研究所,MH 營養瓊脂、MH 肉湯培養 基粉由北京索萊寶科技有限公司提供,胎牛血清由 美國 GIBCO 公司提供。

    1.1.3 實驗儀器

    ZHWY-111B型恒溫培養振蕩器 (上海智城分 析 儀 器 制 造 有 限 公 司),MPJ150型 霉 菌培養 箱 (上 海 科 恒 實 業 發 展 有 限 公 司),YXQ-50SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋 (上海博迅實業有限公司),MicroCL17R 型 高 速 低 溫 離 心 機 (德 國 THERMOIEC公 司),CX31+DP73型 倒 置 顯 微 鏡(奧林巴斯有限公司),TV-1901型紫外可見分光光 度計 (北京普析通用儀器有限公司),DK-914型恒 溫水浴鍋 (上海森信儀器有限公司)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 細菌培養

    分別將甘油凍存的金黃色葡萄球 菌、甲型溶血性鏈球菌、大腸埃希菌和枯草芽胞桿 菌室溫 融 化 后,劃 線 接 種 至 MH 營 養 瓊 脂 平 板, 37 ℃培 養 箱 培 養18~24h,挑 取 典 型 菌 落 接 種 至 MH 肉湯培養基,37 ℃恒溫振搖箱孵育16~18h, 轉速200r/min。

    1.2.2 細菌濃度標準曲線的繪制及菌懸液制備

    將 孵育好的細菌室溫下1000r/min (離心半徑4.3cm) 離心45s收集菌液,重復用無菌生理鹽水洗脫2次, 按倍數稀釋法用無菌生理鹽水依次稀釋原菌液作為 實驗組,其對應的無菌生理鹽水作為空白對照,利 用紫外分光光 度 計 測 定 細 菌 在600nm 時 的 吸 光 度 (A)值,以A 值為橫坐標,菌液濃度為縱坐標,分 別繪制4種細菌的標準曲線,得到回歸方程。確定 所用原菌液濃度為1×108 CFU/mL 的 A 值,然后 1∶100用 MH 液體培養基稀釋至 1×106 CFU/mL 備用。

    1.2.3 蛇毒儲存液配制

    取3種蛇毒分別溶于無菌 生理鹽水中,濃度不低于初始實驗濃度的10倍,經 0.22μm 無菌微孔濾膜過濾除菌,于-20 ℃冷凍保 存備用。

    1.2.4 MIC測定

    分別制備3種蛇毒的 MIC 測定 板,首先在96孔板所有的 V孔內依次加入 MH 肉湯 培養基各100μL。其次,各在 B/C/D 三排的第1個 V 孔內加配好的蛇毒100μL,使第1個孔內的初始 濃度為1280μg/mL,混勻后依次對藥物進行二倍 稀釋,即第1個孔中加入藥液后用移液槍充分吹打 使藥物 與 肉 湯 充 分 混 勻,然 后 吸 取 100μL 加 入 第2個孔再充分吹打使之與肉湯充分混勻,照 此 重 復至最后一孔,混勻后從第12列吸出100μL棄掉。 最后,再在 B/C/D三排的每一孔中加入稀釋好的菌 液10μL,使每個孔內菌液濃度為1×106CFU/mL。 在 A 排上做一排陰性對照 (只 加 MH 肉 湯 不 加 菌 液)和在 H 排上做一排陽性對照 (只加菌液不加藥 液),詳 見 表 1。將 96 孔 板 放 入 37 ℃ 恒 溫 培 養 箱 (內置濕盤保持濕度)培養。

    1.2.5 MIC值 結 果

    讀 取 分別觀測讀取培養 24、 48和72h后的 MIC50、MIC80和 MIC100結果,當陽 性對照孔內細菌明 顯生長時, 采用目測法讀取 MIC50、MIC80和 MIC100數值。以肉眼能觀察到在小 孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度 為 MIC100; 以肉眼能觀察到在小孔內抑制80%細菌生長的最低 藥物濃度為 MIC80;以肉眼能觀察到在小孔內抑制 50%細菌生長的最低藥物濃度為 MIC50。

    2 結 果

    對于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞 桿菌,廣西眼鏡蛇蛇毒的抑菌作用最強,五步蛇蛇 毒的抑菌作用次之,銀環蛇蛇毒最弱;對于甲型溶 血性鏈球菌,五步蛇蛇毒的抑菌作用強于廣西眼鏡 蛇和銀環蛇。對于革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌、甲 型溶血性鏈球菌和革蘭陰性菌大腸埃希菌、枯草芽 胞桿菌,廣西眼鏡蛇蛇毒對革蘭陽性菌的 MIC值均高于其對革蘭陰性菌的 MIC值2倍或2倍以上,提 示革蘭陽性菌對廣西眼鏡蛇蛇毒敏感度低于革蘭陰 性菌的。

    3 討 論

    實驗結果表明廣西眼鏡蛇蛇毒對金黃色葡萄球菌、甲型溶血性鏈球菌、大腸埃希 菌和枯草芽胞桿菌均有不同程度的抑制作用,且作 用較為明顯,推測其主要原因可能為:細胞毒素是 眼鏡蛇蛇毒的主要活性成分,約占蛇毒總蛋白質含 量的40%,具有較強的細胞毒性。細胞毒素與細 菌的細胞膜結合后,通過改變細胞膜的通透性,造 成細胞膜破損,產生穿孔現象,從而導致細胞膜內 容物外 滲,進 而 使 細 菌 死 亡。與 革 蘭 陰 性 菌相比革蘭陽性菌有較厚的肽聚糖,且革蘭陽性菌的 細胞壁比較厚,這可能是廣西眼鏡蛇蛇毒對革蘭陽 性菌的抑菌效果比革蘭陰性菌差的原因之一。實驗 數據表明五步蛇蛇毒也具有一定的抗菌作用,可能 與五步蛇蛇毒中也含有少量細胞毒素有關,五步 蛇蛇毒對甲型溶血性鏈球菌的抑制作用比較強,原 因有待進一步研究。銀環蛇蛇毒無明顯抑菌作用可 能與其蛇毒成分中以神經毒素為主有關,神經毒素 毒性較強,可有神經肌肉阻斷作用,嚴重時可導致 外周呼吸麻痹引起死亡,但小劑量的神經毒素可 能仍不足以對細菌有抑制作用。

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