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    長尾倉鼠SSR位點的篩選與擴增-水浴鍋使用

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-10-24 10:14【

    1991 年,MOORE 等提出了微衛星 DNA(Microsatellite DNA)的概念,即 SSR(Simple Sequence Repeats)位點,是一類由 1~6 個核苷酸為重復單位 組成的長達 200~800 bp 的核苷酸串聯重復序列。 微衛星位點中大量重復的部分很可能存在變異,變 異會表現為數目的整倍性不同或序列的不完全相 同,因而造成位點的多態性。而揭示這些變異,進而 發現不同的 SSR 在不同的種甚至不同個體間的多 態性,是 SSR 標記技術的目的。

    1 材料和方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 動物材料

    在野外捕獲活體長尾倉鼠后,取 其尾尖為 DNA 提取材料。捕獲地及數量見表 1。

    1.1.2 試劑

    血液 / 細胞 / 組織基因組 DNA 提取 試劑盒 (天根生化科技有限公司),2×Taq PCR MasterMix 酶(天根生化科技有限公司),ddH2O,瓊 脂糖,1×TAE,30%聚丙烯酰胺(生工生物工程股份 有限公司),5×TBE,過硫酸銨,TEMED,GeStain 染 液(全式金有限公司),NaCl。

    1.1.3 儀器

    電熱恒溫水浴鍋(上海博訊實業有限公司醫療設備廠);微型高速離心機 Centrifuge 5424 (北京伯樂生命科學發展有限公司);瓊脂糖凝膠電 泳槽(北京六一儀器廠);聚丙烯酰胺凝膠電泳槽(北 京六一儀器廠);凝膠成像系統(Alphalmager HP); G1000 基因擴增儀(杭州博日科技有限公司);DNA 定量儀 NANODROP 2000(賽默飛世爾科技公司)。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 引物設計與合成

    試驗所采用的引物借鑒 了與長尾倉鼠同屬的黑線倉鼠 SSR 位點引物, 并由生工生物工程股份有限公司合成。具體序列以 及特點列于表 2。

    1.2.2 長尾倉鼠基因組DNA的提取

    采集長尾倉鼠尾尖作為 DNA 提取材料,用 DNA 提取試劑盒提取基因組 DNA。采用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測有目 標條帶后,對其進行定量分析。

    2 結果與分析

    1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 含量和質量, DNA 提取結果經瓊脂糖凝膠電泳鑒定觀察結果如 圖 1 所示,質量較好。經 DNA 定量分析,其濃度平 均達到 1.8 ng/μL,表明濃度足夠,符合進行 SSR 位 點擴增的試驗要求。應用與長尾倉鼠同屬的黑線倉鼠 SSR 引物擴 增后的電泳結果顯示,引物 SSRf6 的擴增結 果(F)不明顯,長尾倉鼠很可能不存在這一位點,其 他 5 個位點表現的多態性都較好。

    3 討論

    非變性聚丙烯酰胺凝膠具有很高的分辨力,能 很好地分離小片段 DNA(5~500 bp),甚至可以分 離相差 1 bp 或分離單堿基突變所引起的不同片 段。但不同濃度會影響擴增條帶的清晰度。本研究 為了確定分離片段所需最適聚丙烯酰胺的濃度進 行了預試驗,分別測試了 8%,10%,12%的聚丙烯 酰胺凝膠,從預試驗結果來看,8%的聚丙烯酰胺 凝膠帶型最整齊且雜帶少,便于觀察分析試驗結果。

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