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    博迅分析復氧損傷心肌細胞的機制

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-10-15 13:01【

    冠心病( CHD) 是冠狀動脈血管發生動脈粥樣 硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞,造成心肌缺血、 缺氧或壞死而導致的心臟病。臨床上主要有藥 物治療、經皮冠狀動脈介入治療及冠狀動脈旁路移 植術; 但是在恢復心肌血流的同時,由于氧自由基大 量產生,導致心肌凋亡通路激活,可能會加重心肌細 胞結構 及 功 能 的 損 傷,即 心 肌 缺 血/再 灌 注 損 傷 ( MI /RI) 。MI /RI 降低了缺血性心臟病的治療效 果,增加了患者負擔。因此,尋找有效的方法防治 MI /RI 成為亟待解決的問題。

    1 材料

    1. 1 細胞

    大鼠子一代 H9c2 心肌細胞,購于上海子實生物科技有限公司。

    1. 2 藥物與試劑

    瓜蔞皮藥材收集于河北省安國 市,經遼寧中醫藥大學中藥鑒定教研室李峰教授鑒 定為葫蘆科植物栝樓的干燥成熟果皮; Na2 S2O4 ( 美 國百靈威科技有限公司,純 度 85% ) ; NO,eNOS, iNOS 酶聯免疫吸附測定( ELISA) 試劑盒( 上海聯碩 科技有限公司,批號均為 201804) ; 兔抗大鼠 Akt,磷 酸化( p) -Akt( Ser 473) ,eNOS,iNOS,甘油醛-3-磷酸 脫 氫 酶 ( GAPDH ) 抗 體 ( 美 國 Cell SignalingTechnology 公司,批號均為 BC18AA0047) ; 辣根過氧 化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白( Ig) G 二抗,牛血 清白蛋白( BSA) ( 上海碧云天生物技術有限公司, 批號分 別 為 B0802,P2300 ) ; 噻唑 藍 ( MTT) ,SDSPAGE 凝膠制備試劑盒( 北京索萊寶科技有限公司, 批號分別為 CA1020,P1200) ; 二甲基亞砜( DMSO, 美國 Sigma 公司,批號 201806270285) ; DMEM 高糖 培養基,胎牛血清( FBS) ,0. 25% 胰蛋白酶( 美國 Gibco 公司,批號均為 G18032) ; 1% 青霉素-鏈霉素 雙抗、磷酸鹽緩沖液( PBS) ( 美國 Hyclone 公司,批 號分 別 為 J180012,J170035 ) ; 細胞 裂 解 液,EZ-10 DNAaway RNA 小量提取試劑盒,PCR 引物,動物全 蛋白提取試劑盒[生工生物工程( 上海) 股份有限公 司,批 號 分 別 為 D612002,B518651,B662204, 600530-53]; ProtoScript  Ⅱ 反轉 錄 試 劑 盒 ( 美 國 NEB 公司,批號 0041509) ; 聚偏二氟乙烯( PVDF) 膜 ( 美國 Merck Millipore 公司,批號 421302) ; BCA 蛋 白濃度測定試劑盒,ECL 化學發光試劑盒( 上海碧 云天生物技術有限公司,批 號 分 別 為 P0007, N1410) ; 實驗用水為超純水。

    1. 3 儀器

    Thermo HERAcell 150i 型 CO2 細胞培 養箱,NanoDrop 2000 型超微量分光光度計( 美國 Thermo Scientific 公司) ; MR18. 22 型超速低溫離心 機( 法國 Jouan 公司) ; CP225D 型微量電子天平( 德 國 Sartorius 公司) ; Infinite M200 型多功能酶標儀 ( 瑞士 Tecan 公司) ; BD FACSVerse 型流式細胞儀 ( 美國 BD 公司) ; Stratagene Mx 3000P 型實時熒光 定量聚合酶鏈式反應 ( Real-time PCR) 儀 ( 美 國 Agilent 公司) ; JY200C 型電泳儀( 北京君意電泳設 備有限公司) ; Tanon-5200 型凝膠成像系統( 上海天 能科技有限公司) 。

    2 方法

    2. 1 藥物制備及溶液配制

    稱取干燥的瓜蔞皮粉 末 100. 0 g,加入蒸餾水 1 000 mL 浸泡 30 min,煎煮 2 h,8 層紗布過濾。濾渣重復提取 2 次,合并濾 液,減壓濃縮至 100 mL,再經真空冷凍干燥,即得樣 品( 得率為 19. 5% ) ,于 4 ℃保存備用。 精密稱取干燥的瓜蔞皮水提物 20. 0 mg,溶于 DMEM 高糖培養基中,配制成 2. 0 g·L - 1的儲存液, 0. 22 μm 濾器過濾除菌,置于 4 ℃ 冰箱備用。根 據后續的實驗需求,以 DMEM 高糖培養基稀釋成相 應終質量濃度( 50 mg·L - 1 ) 。 精密 稱 取 Na2 S2O4 30. 72 mg,溶于 PBS 溶 液 15. 0 mL 中,配成 10 mmol·L - 1 Na2 S2O4 儲備液,再用 PBS 稀釋成規定濃度,避光,現用現配。

    2. 2 細胞培養

    取 H9c2 心肌細胞,用含 10% FBS, 1% 雙抗的 DMEM 高糖培養基( 以下簡稱培養液) 于 37 ℃ 5% CO2 的細胞培養箱中培養( 以下培養條件 相同) ,適時換液。當細胞覆蓋率達到 80% 以上時, 即可進行傳代。傳代至第 5 代時,取對數生長期細 胞進行實驗。在每次實驗前,吸棄各培養瓶中的培 養液,換 0. 5% FBS 的培養液“饑餓”12 h,進行心肌 細胞同步化處理。

    2. 3 細胞造模、分組及給藥

    根據文獻報道及前期 實驗工作,心肌細胞的缺氧/復氧模型按照 2. 2 項下方法培養細胞。將培養液吸出,用 PBS 洗滌對 數生 長 期 細 胞 1 ~ 2 次 后 換 上 2. 5 mmol·L - 1 Na2 S2O4 溶液,置于 37 ℃ 5% CO2 95% 空氣細胞培 養箱內 30 min,造成細胞缺氧; 再將缺氧培養基換成 培養液置于 37 ℃ 5% CO2 95% 空氣細胞培養箱內 4 h,使細胞復氧。 根據前期瓜蔞皮提取物給藥劑量的篩選及預實驗,按照 2. 2 項下方法培養細胞,隨機分為正常 組: 正常培養,不進行缺氧復氧處理; 模型組( H /R 組) : 細胞缺氧 30 min,復氧 4 h; 瓜蔞皮提取物組 ( 50 mg·L - 1 ) : 藥物 預 孵 育 24 h,然 后 造 成 缺 氧 30 min,復 氧 4 h; 抑 制 劑 組 ( LY294002, 10 μmol·L - 1 ) : 抑制劑與瓜蔞 皮提取物 ( 50 mg·L - 1 ) 共 同 預 孵 育 24 h,然 后 造 成 缺 氧 30 min,復氧 4 h。

    2. 4 各組細胞活力的檢測

    按照 2. 2 項下方法培養 細胞。取對數生長期的心肌細胞,以 1 × 105 個/mL 的密度接種于 96 孔板,每孔 100 μL,按照 2. 3 項下 方法進行隨機分組、給藥預處理及造模。復氧后,根 據 MTT 說明書,處理結束后的各組細胞每孔加入 MTT 溶液( 5 g·L - 1 ) 20 μL,避光孵育 4 h; 吸去培養 液,加入 DMSO 150 μL 渦旋振蕩 10 min,使結晶充 分溶解; 用酶標儀在 570 nm 波長處測定吸光度 A。 另設空白組,加入相應量培養液和 MTT,DMSO 試劑 但不加入細胞。每種處理設 6 個復孔,實驗重復 3 次。根據以下公式計算存活率。 細胞存活率 = ( A1 - A0 ) /( A2 - A0 ) × 100% 式中 A1 是實驗組的吸光度; A2 是正常組的吸 光度; A0 是空白組吸光度。

    2. 5 ELISA 檢測

    各 組 細 胞 NO 釋 放 量 及 eNOS, iNOS 活 性 水 平 取對數生長期細胞,以 1 × 105 個/mL的密度接種于 24 孔板,每孔 0. 5 mL。按 照 2. 3 項下方法進行隨機分組、給藥預處理及造模。復氧后,取各組心肌細胞上清液按試劑盒說明書檢 測 NO 釋放量; 預冷 PBS 洗滌細胞后加入細胞裂解 液,30 min 后收集細胞裂解液,按試劑盒說明書檢測 eNOS,iNOS 的活性水平。

    3 結果

    與正 常組比較,心肌細胞經缺氧/復氧后,細胞存活率顯 著降低( P < 0. 01) ,表明缺氧/復氧模型復制成功。 50 mg·L - 1瓜蔞皮提取物單獨預處理后,與模型組比 較,細胞存活率升高; 與 50 mg·L - 1瓜蔞皮提取物組 比較,PI3K 特異性抑制劑 LY294002 預處理后抑制 了細胞活性( P < 0. 01) 。與正常組比較,模型組細胞中 NO 釋放量, eNOS 水平均顯著降低( P < 0. 01) ; 與模型組比較, 50 mg·L - 1瓜蔞皮提取物單獨預處理 24 h 后,NO 含 量,eNOS 水 平 顯 著 升 高 ( P < 0. 01) ; 抑 制 劑 LY294002 預處理后,在相同濃度的瓜蔞皮水提物預 處理條件下 LY294002 ( + ) 和 LY294002 ( - ) 組之 間比較,NO 含量和 eNOS 活性水平均明顯降低( P < 0. 05) ; 而各組細胞 iNOS 的活性水平與 eNOS 的變 化趨勢相反。與正常組比較,模型組細胞 中 Akt,p-Akt,eNOS 的蛋白表達水平顯著降低, p-Akt /Akt 顯 著 降 低 ( P < 0. 01 ) ; 與模 型 組 比 較, 50 mg·L - 1瓜蔞皮提取物單獨預處理 24 h 后,Akt, p-Akt,eNOS 的蛋白表達水平都升高,p-Akt /Akt 顯 著上升( P < 0. 01) ; 抑制劑 LY294002 預處理后,在 相同濃度的瓜蔞皮水提物預處理條件下 LY294002 ( + ) 和 LY294002 ( - ) 組 之 間 相 比,Akt,p-Akt, eNOS 的蛋白表達水平均降低,p-Akt /Akt 下降( P < 0. 01) ; 而各組細胞 iNOS 的蛋白表達水平與 eNOS 的變化趨勢相反。

    4 討論

    心肌缺血、缺氧可導致心肌代謝功能異常和結 構破壞,從而引發胸痛或胸部不適,屬中醫“胸痹” “真心痛”的范疇。臨床上主要采用藥物治療 法、經皮冠狀動脈介入治療及冠狀動脈旁路移植術 等治療心肌缺血; 但是在心肌血流恢復的同時,由于 氧自由基大量產生,導致心肌凋亡通路激活,可能會 加重心肌細胞結構及功能的損傷,即心肌缺血再灌 注損傷( MI /RI) 。由于誘發 MI /RI 的原因較為復雜,涉及到氧化應激、細胞凋亡、鈣超載和能量代 謝等,目前尚未發現安全有效的治療方法。因 此,尋找有效的藥物來預防和治療心肌缺血性疾病 對于臨床實踐有著重要的意義。

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