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    上海一恒分析細胞遷移和侵襲的影響

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-09-19 13:50【

    結直腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤,其發病 率和死亡率呈逐年上升趨勢,發病率在惡性腫 瘤中排名第 4 位,死亡率居第 5 位。手術、放 療、化療為結直腸癌主要治療方式,但毒副作用較 大,預后效果不佳,故尋找毒副作用較小的高 效藥物具有重要意義。

    1 材料

    人正常結腸上皮細胞 NCM460、人結腸癌細胞 SW620 購自中國典型培養物保藏中心 ( CCTCC) 。 胎牛血清、RPMI-1640 培養基、二甲基亞砜 ( DMSO) 購自美國 Gibco 公司; 槲皮素、胰蛋白酶購 自北京索萊寶科技有限公司; BCA 試劑盒、PBS 緩 沖 液、 MTT 試 劑 盒 購 自 美 國 Sigma 公 司; Transwell 小 室 購 自 美 國 Corning 公 司; β-actin、 STAT3 一抗購自英國 Abcam 公司; HRP 二抗購自 上海 碧 云 天 生 物 科 技 公 司; Trizol 試 劑、 Lipofectamine TM 2000、SDS-PAGE 試劑盒購自美 國 Invitrogen 公司; TaKaRa 反轉錄試劑盒、熒光定 量試劑 盒 購 自 寶 生 物 工 程 ( 大 連) 有 限 公 司; PVDF 膜購自美國 Millipore 公司; ABI-7300 實時熒 光定量 PCR 儀購自上海普迪生物技術有限公司; NanoDrop 微量核酸測定儀購自美國賽默飛世爾科 技公司; 凝膠成像分析儀購自柯達公司。

    2 方法

    2. 1 細胞培養及轉染

    含 10%胎牛血清的 RPMI1640 培養基于 37 ℃、5% CO2 下培 養 NCM460、 SW620 細胞,每 2 d 換液 1 次,細胞匯合度達到 80%后用 0. 25% 胰酶消化并傳代,待細胞生長狀 態穩定后取對數生長期細胞用于后續實驗。收集匯 合度約 50%的 SW620 細胞,按照 Lipofectamine TM 2000 轉染試劑說明書 分別加入轉染試劑 Lipofectamine 與 si-NC、 si-STAT3、 pcDNA、 STAT3,并依次標記為 si-NC 組、si-STAT3 組、槲 皮素+pcDNA 組、槲皮素+STAT3 組。

    2. 2 給 藥 及 分 組

    DMSO 溶 解 槲 皮 素,配 成 20 mmol /L貯備 液,于 - 20 ℃ 下 保 存,使 用 時 用 RPMI-1640 培養液稀釋,用于細胞培養。將其加入 到 SW620 細胞培養液中,槲皮素終濃度分別為 0、 25、50、100 μmol /L,重復 5 次,各組細胞置于上海
    博迅BPX-82電熱恒溫培養箱中,37 ℃、5% CO2 下 常 規 培 養 24 h, 50 μmol /L槲皮素處理的細胞分別培養 0、24、48、 72 h,每組重復 5 次。

    2. 3 細胞存活率檢測

    采用 MTT 法。取槲皮素 0 μmol /L 組、 25 μmol /L 組、 50 μmol /L 組、100 μmol /L組,si-NC 組,si-STAT3 組細胞,在轉 染后的槲皮素+pcDNA 組和槲皮素+STAT3 組細胞 培養液中加入槲皮素,調整終濃度為 50 μmol /L。 培養 24 h 后,各組細胞加入 20 μL MTT 孵育 4 h, 棄去 培 養 基,每 孔 加 150 μL DMSO,振 蕩 溶 解 10 min,酶 標 儀 檢 測 490 nm 波長處各孔光密度 ( OD) 值,計算存活率,公式為存活率= ( 實驗組 OD 值/對照組 OD 值) ×100%。

    2. 4 細胞遷移和侵襲檢測

    采用 Transwell 法。各 組細胞加入 2. 5 μg /mL 絲裂霉素 C 干預 24 h 以抑 制細胞分裂,培養結束后加入適量胰酶消化,PBS 緩沖液清洗后用無血清培養基重懸細胞,調整密度 為 3×104 /mL,取 200 μL 接種于包被、未包被基質 膠的小室中,放到含完全培養基的下室中常規培養 24 h,棄去多余培養基,PBS 緩沖液洗滌后加入 4%多聚甲醛固定 30 min,0. 1%結晶紫染色10 min, 顯微鏡觀察并隨機選取 6 個視野拍照,計數。

    2. 5 STAT3 mRNA 表達檢測

    采用 RT-PCR 法。 收集各組對數生長期的細胞,充分研磨后加入 Trizol 試劑提取總 RNA,NanoDrop 微量核酸測定儀 檢測 RNA 純度和濃度,凝膠電泳系統檢測 RNA 完 整性。TaKaRa 反轉錄試劑盒將 RNA 反 轉 錄 成 cDNA,按照 TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配 制反應體系,以 β-actin 為內參,置于 ABI-7300 實 時熒光定量 PCR 儀上進行擴增,每個樣品重復 3 次,引物序列見表 1,采用 2-ΔΔCt 法進行分析

    3 結果

    與對照組 ( 0 μmol /L) 比較,50、100 μmol /L槲皮素處理后細胞存活率顯著降低 ( P<0. 05) ,考 慮到成本方面,選擇 50 μmol /L; 與對照組 ( 0 h) 比較,50 μmol /L 槲皮素處理 24、48、72 h 后其存 活率也顯著降低 ( P<0. 05,P<0. 01) ,考慮到效率 方面,選擇 48 h。與對照組比較,槲皮素組 STAT3 蛋白表達顯著下調 ( P < 0. 05) ,而過表達 STAT3 后槲皮素+STAT3 組蛋白表達顯著上調 ( P< 0. 05) ; 槲皮素組細胞存活率、遷移數目、侵襲數 目顯著降低 ( P<0. 05) ,而過表達 STAT3 后槲皮 素+STAT3 組生存、遷移、侵襲能力顯著增強 ( P< 0. 05) 。




     


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