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    淺談毛脈酸模次生代謝產物的影響原因分析

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-08-27 11:20【

    內生真菌( endophytic fungi) 是指生活在植物體 內的一類真菌,在寄主中度過全部或近乎全部生活周 期而不使寄主表現任何癥狀,可以經對植物組織內直 接擴增微生物 DNA 的方式來證明其在內部的真實存。內生真菌廣泛存在于植物的健康組織內,是植 物微生態系統的重要組成部分。在長期的進化過程 中,一些共存的內生真菌與其宿主植物相互建立了特 殊的關系,這種關系可以顯著影響植物中有效成分的 形成,從而影響藥用植物的質量和數量。



    1 儀器與試藥

    1. 1 儀器


    AE240 分析天平( 瑞士 METTOER TOLEDOGO公司) ; 光照培養箱( 杭州匯爾儀器設備有限公司) ; BGZ-240 電熱鼓風干燥箱( 上海博迅實業有限公司 醫療設備廠) ; 立式壓力滅菌器( 上海博迅實業有限 公司醫療設備廠) ; BJ-1CD 潔凈工作臺( 上海博迅實業有限公司醫療設備廠) ; LT501E 電子天平( 常 熟市天量儀器有限責任公司) ; 生化培養箱( 上海博 迅實業有限公司醫療設備廠) ; 振蕩培養箱( 上海博迅實業有限公司醫療設備廠) ; FS-1 型可調高速勻 漿機( 上海比朗儀器有限公司) ; KDM 型調溫電熱套 ( 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司) ; R201 旋轉蒸 發儀( 瑞士布奇 BUCHI) ; e2695 型高效液相色譜儀 ( 美國 waters 公司) ; WND200 中藥粉碎機( 偉能達 電器有限公司) 。



    1. 2 試藥

    毛脈酸模 Rumex gmelini Turcz. 種子取自黑龍江 中醫藥大學藥用植物園,經黑龍江中醫藥大學王振 月教授鑒定。毛脈酸模內生真菌,由課題組前期分 離得到菌株 J-G( Plectosphaerella Sp. ) 。 MS 培養基( 不含瓊脂和蔗糖,青島賓得生物技 術有限公司) ; 瓊脂( 北京奧博星生物技術有限責任公 司) ; 無水乙醇( 天津天力化學試劑有限公司) ; 白藜 蘆 醇 苷 對 照 品 ( 批 號: MUSH-1616062102,純 度 99. 78% ) 、白藜蘆醇對照品( 批號: MUSH-12032106, 純度99. 50% ) 均購自成都曼思特生物科技有限公司; 大黃酚-8-O-葡萄糖苷對照品( 批號: CS1611TZ01,純 度 98%,上海澄紹生物科技有限公司) ; 酸模素對照 品( 批號: AB161206054,純度 98%,成都埃法生物科 技有 限 公 司) ; 蘆薈大黃素對照品( 批 號: 110795- 201609,純度98. 1% ) 、大黃酸對照品( 批號: 110757- 201607,純度99. 3% ) 、大黃素對照品( 批號: 110756- 200110,純度99. 5% ) 、大黃酚對照品( 批號: 110796- 201017,純 度99. 6% ) 、大黃素甲醚對照品( 批 號: 110758-201013,純度99. 8% ) 均購自中國食品藥品檢 定研究院。 



    2 方法與結果

    將冷藏于試管中的 毛脈酸模內生真菌 J-G 取出,用 75% 乙醇對試管表 面消毒后,置于經紫外滅菌 30 min 的超凈工作臺 中,用酒精燈灼燒接菌環的上半部分,待接菌環冷卻 后,使試管傾斜 45°,將接菌環伸入試管中,挑取部 分菌絲接入經高壓滅菌的新鮮的 PDA 培養基,將接 過菌的新鮮培養基放入培養箱,28℃暗培養 1 周。真菌 J-G 接入經高壓滅菌的液態 PDB 培養基中,在震蕩培養箱中 28℃無光條件以 120 r·min - 1 的轉速 震蕩培養。培養 7 d 后,從搖瓶中收獲真菌,用抽濾 機將菌絲濾出,并用蒸餾水洗滌數次。將每 10 g 新 鮮真菌生物量重新懸浮于 100 ml 蒸餾水中,通過勻 漿機強烈機械攪拌后,高壓滅菌。滅菌的真菌勻漿 作為實驗中的誘導劑。將飽滿的毛脈酸 模種子用 120 目砂紙摩擦后,放入蒸餾水中浸泡 24 h,然后將種子取出,用 75% 的酒精浸泡 2 min,用無 菌水沖洗 3 次,再用 2% NaClO 浸泡 10 min,然后無 菌水沖洗 5次。將處理過的種子接種于無菌的 MS 固體培養基( MS + 蔗糖 + 瓊脂) 上,每個培養皿 中均勻接入 10 粒種子,用封口膜將培養皿封住,放 置于光照培養箱中在培養溫度( 晝/夜) 25 ℃ /18 ℃、光照周期 14 /10 h、光照強度 3 000 Lx 的條件下 培養,至種苗長出 3 片真葉。以上種子消毒及接到 MS 培養基的過程均需在超凈工作臺中進行。選取 54 瓶長 勢一致的毛脈酸模無菌苗,分 18 組,每組 3 瓶,在潔 凈工作臺中,用無菌注射器向 27 瓶含有毛脈酸模無 菌苗的錐形瓶中注入制備好的內生真菌誘導子 5 ml,其余 27 瓶作為空白對照,培養條件與放置于光 照培養箱中在培養溫度( 晝/夜) 25 ℃ /18 ℃、光照 周期 14 /10 h、光照強度 3 000 Lx 的條件下培養,每 5 d 更換一次培養基,分別在培養 5,10 ,15 d 的時 候收獲試驗組( 各 3 組) 和空白對照組( 各 3 組) 的 植物根部。



    3 討論

    本研究利用內生真菌 J-G 誘導子與毛脈酸模幼 苗共培養,在不同培養時間檢測實驗組幼苗相對于 空白對照組的含量變化,結果發現白藜蘆醇和白藜 蘆醇苷等二苯乙烯類成分含量顯著提高,酸模素和 蒽醌類成分含量在誘導過程中呈現先增高后降低的趨勢。由此發現誘導子短時間( 5 d) 作用對毛脈酸 模中次生代謝產物的積累具有顯著的促進作用。誘 導子是內生真菌菌絲滅活制得的,化學本質是無毒 力作用的寡糖、蛋白質等,因此不會對植株的生長產 生抑制作用,可能由于內生真菌的誘導子特異性地 誘導了特定基因的表達,觸發植物細胞間復雜的反 應,導致次生代謝產物的合成和積累。



     


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