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    用博迅工作臺對減輕退變軟骨細胞的損傷

    返回列表 來源:未知 發布日期:2020-01-08 10:05【

    1 材料和方法 


    1.1 設計 


    細胞學實驗。 


    1.2 時間及地點 


    實驗于2017年9月至2018年9月在廣西 醫科大學基礎實驗室完成。 


    1.3 材料 


    1.3.1 動物 


    清潔級新生24 h內的雄性SD大鼠2只,由廣 西醫科大學實驗中心提供,動物許可證號 SCXK 桂 2014-0002。實驗于2017年10月經廣西醫科大學動物實驗倫理委員會批準,批準號201710008。 


    1.3.2 主要試劑 


    原兒茶酸(純度≥98%,白色結晶粉末)、 100×青霉素-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶、蘇木精-伊紅染色 試劑盒購自北京索萊寶有限公司;胎牛血清、DMEM培養 基購自Gibeo公司;黃綠素、MTT、碘化丙啶(PI)購自美國 Invitrogen公司;Ⅱ型膠原一抗、DAB顯色試劑盒購自博士 德公司;Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司;PBS購自邁新 公司購;番紅染色試劑盒購自基爾頓生物科技(上海)有限 公司;總RNA提取試劑盒購自天根公司。 


    1.3.3 主要儀器 


    二氧化碳恒溫培養箱購自賽默飛世爾 科技(中國)有限公司;倒置相差顯微鏡購自Olympus公司; 全波長酶標儀、微量紫外分光光度計購自Themo公司;超 凈工作臺購自上海博迅實業有限公司;熒光實時定量PCR 儀購自美國Eppendorf公司。 


    1.4 方法 


    1.4.1 軟骨細胞的提取與培養 


    將2只乳鼠拉頸處死,浸泡 于體積分數75%乙醇中消毒15 min后,無菌條件下切除兩側 股骨,用眼科剪將股骨兩端軟骨剪下,用含青鏈霉素雙抗液 的PBS沖洗數次;將軟骨組織剪碎至約1 mm3 大小,轉移到 15 mL離心管中加入0.25%胰蛋白酶消化30 min,棄上清液, PBS清洗3次,加入2 g/L的Ⅱ型膠原酶并置入體積分數5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中消化3.0-4.0 h。200目不銹鋼篩網 過濾后,收集細胞,1 000 r/min離心5 min;棄上清液,加入 含體積分數10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養 基,用吸管反復吹打重懸細胞,接種于10 cm培養皿中,于 37 ℃,體積分數5% CO2培養箱中培養。24 h后換培養液除 去未貼壁細胞,之后每3 d換液,細胞融合后用0.25%胰酶消 化3-5 min,含體積分數10%胎牛血清DMEM培養基終止消 化,按1∶3的比例傳代。取第3代細胞用于后續實驗。 


    1.4.2 細胞毒性測定 


    以MTT法測量原兒茶酸對關節軟骨 細胞的細胞毒性作用。將細胞按2 000個/孔接種于96孔培養 板中,8 h后更換含有不同濃度原兒茶酸(1-150 mg/L)的 DMEM培養基(含體積分數10%胎牛血清),繼續培養24 h。 每孔加 20 mL MTT(5 g/L),置于細胞培養箱中4 h;去培養 基,每孔加150 μL DMSO,孵育10 min,酶標儀測量570 nm處的吸光度值。

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    1.4.3 細胞分組與干預 


    第3代軟骨細胞分為5組:空白 組、模型組、原兒茶酸低劑量(10 mg/L)組、原兒茶酸中劑 量(30 mg/L)組、原兒茶酸高劑量(50 mg/L)組,每組設置3 個副孔。其中空白組僅加入培養液;模型組加入含10 mg/L 的白細胞介素1β的培養液;原兒茶酸低、中、高劑量組加 入含10 mg/L白細胞介素1β的培養液以及10,30,50 mg/L 原兒茶酸。干預時間為24 h。


    2 結果 


    2.1 原兒茶酸對大鼠軟骨細胞增殖抑制作用 


    MTT檢測 結果顯示,在10-50 mg/L的濃度范圍內,原兒茶酸能夠明 顯促進軟骨細胞的增殖,其中30 mg/L原兒茶酸的生長刺激 作用最強。大于50 mg/L的原兒茶酸可明顯抑制軟骨細胞的 增殖,見圖1,因此實驗選擇10,30,50 mg/L作為后續實 驗研究的有效濃度。 


    2.2 原兒茶酸對大鼠軟骨細胞 DNA 含 量 的 影 響 


    Hoechst 33258結果顯示,原兒茶酸中劑量組DNA含量接 近于空白組,原兒茶酸低劑量組和原兒茶酸高劑量組DNA 含量較原兒茶酸劑量組低,說明30 mg/L原兒茶酸能更有效 保護軟骨細胞,促進軟骨細胞的增殖,見圖2。

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    3 討論 


    隨著社會老齡化程度的進展,退行性骨關節炎病患越 來越多。骨性關節炎一般以疼痛、腫脹等臨床癥狀多見, 給患者帶來巨大的痛苦和經濟上的負擔。關節軟骨由于缺 乏神經血管等組織,導致其再生能力較差。已有研究表明 關節軟骨細胞是維持軟骨基質的合成和分解代謝的惟一細胞類型并證明了關節軟骨細胞的過度凋亡是骨關節炎發病的主要原因。



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