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    用博迅干燥箱對HepG2細胞胰島素抵抗模型中脂代謝

    返回列表 來源:未知 發布日期:2020-01-03 09:03【

    1 材料與方法 


    1. 1 材料

    1. 1. 1 細胞株

    HepG2 細胞人肝癌細胞株,購于中 國科學院細胞庫。

    1. 1. 2 藥物及試劑

    苦酸通調方( 長春中醫藥大 學附屬醫院藥房提供) ; 二甲雙胍( HY-17471A,MCE 公司) ; DMEM 低糖培養基、胎 牛 血 清( 12100061、 16140071,Gibco 公司) ; 細胞裂解液、噻唑藍( MTT) 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒( P0013、C0201,武 漢碧云天生物公司) ; 棕櫚酸( MB7088,大連美侖生 物技術有限公司) ; 油紅 O 染色試劑盒、三酰甘油 ( TG) 檢測試劑盒、膽固醇檢測試劑盒( D027、A110、 A111,南京建成生物工程研究所) ; 兔抗人單克隆抗 體 AMPKα,單克隆抗體 p-AMPK( Thr172) ,單克隆 抗體乙酰輔酶 A 羥化酶( ACC) ,多克隆抗體 p-ACC ( Ser79) ( 美 國 Cell Signaling 公 司,批 號 分 別 為 5832,50081,9272,9336) ; 兔單克隆抗體 SREBP-1 ( 557036,美國 BD 公司) ; 辣根過氧化物酶標記山羊 抗兔多克隆抗體免疫球蛋白( Ig) G、辣根過氧化物 酶標 記 山 羊 抗 小 鼠 單克隆抗體 IgG ( BA1054、 BA1050,武漢博士德生物工程有限公司) ; 二喹啉甲 酸( BCA) 蛋白濃度測定試劑盒( A0216,碧云天生物 技術研究所) 。

    1. 1. 3 儀器

    濕化型 CO2 恒溫培養箱( 3111,Thermo) ; YZ-875 超凈工作臺( 江蘇蘇州凈化設備廠) ; 低溫高速離心機( 5804R,德國 Eppendorf) ; DK-S2 微 型振蕩器( 浙江金華實驗儀器廠) ; 鼓風干燥箱( 上海博迅醫療生物儀器公司) ; M200 PRO 酶標儀( 瑞 士 Tecan 公司) ; 電泳儀( 美國 Bio-Rad 公司) ; 濕轉 系統( 美國 Bio-Rad 公司) ; 超低溫冰箱( 900,美國 Thermo Fisher) ; ECL 發 光 儀 ( 美 國 Protein Simple 公司) 。

    1. 2 細胞培養

    HepG2 細胞培養在 37℃,5%CO2 濕化 條 件 中,給 予 10% 胎 牛 血 清 ( FBS) 、青 霉 素 100 U/ml和鏈霉素 100 μg /ml 的低糖 DMEM 培養 基培養,待細胞融合度約 80%時進行傳代。各干預 組加入無血清低糖 DMEM 培養基培養細胞 24 h,使 各組細胞生長同步化后再進行下一步實驗。

    1. 3 MTT 比色法檢測細胞活力

    將 MTT 溶于磷酸 鹽緩沖液( PBS) 為 5 mg /ml 過濾除菌后備用,選擇 細胞融合度約 80%的 HepG2 細胞,胰酶消化后,以 8 000 個細胞/孔的密度接種于 96 孔板。細胞貼壁生 長 24 h,吸棄原培養基,加入不同的干預液100 μl, 培養 24 h,每孔加入 MTT 溶液 10 μl,置細胞于培養 箱內避光孵育 4 h。震蕩混勻,490 nm 處測定吸光 度。以對照組細胞的存活率為 100%計算不同組別 細胞存活率。

    1. 4 高糖聯合棕櫚酸孵育建立

    HepG2 IR 模型 稱 取 9. 165 mg 棕櫚酸標準品溶于 0. 25 ml 無水乙醇 中,將溶解后的棕櫚酸加入 11. 88 ml 高糖 DMEM 培 養〔其中含有 0. 12 ml FBS,0. 25 g 牛血清白蛋白 ( BSA) 〕,55℃ 水浴 15 min,冷卻后過濾除菌即為 3 mmol /L棕櫚酸溶液,造模時稀釋至 0. 25 mmol /L, 孵育細胞 24 h,建立 HepG2 IR 模型。


    2 結 果

    2. 1 對 HepG2 細胞葡萄糖攝取量的影響

    與正常 組〔( 1. 00±0. 02) mmol /L〕比較,模型組細胞的葡萄 糖攝 取 量 明 顯 下 降 〔( 0. 63 ± 0. 02 ) mmol /L,P < 0. 05〕; 與模型組相比,苦酸通調方高劑量組、陽性 對照 組 顯 著 增 多 HepG2 IR 細胞葡萄糖攝取量 〔( 0. 84± 0. 05) mmol /L,( 0. 93 ± 0. 02) mmol /L,P < 0. 05〕,且增加細胞葡萄糖攝取量的效果呈劑量依 賴性。苦酸通調方低、中劑量組攝取量為〔( 0. 66± 0. 03) mmol /L,( 0. 72±0. 03) mmol /L〕與模型組無差 異( P>0. 05) 。

    2. 2 油紅

    O 染色 造模液作用后細胞內脂滴明顯 增多,隨著苦酸通調方濃度的增加,細胞脂滴逐漸減 少。見圖 1。

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    3 討 論

    中醫認為 T2DM 屬“消渴”“脾癉”范疇,苦酸通 調方依據六郁和絡滯病機,確立“苦酸制甜”、“辛開 苦降”、“活血通絡”、“解毒通絡”為基本治法,選用 丹參、黃連、黃芪、知母、天花粉、制紅曲、肉桂、烏梅、 生地、酒大黃組成本方。諸藥辛苦酸并用,寒溫相 佐,達到了苦酸制甜,辛開苦降,通達絡脈之功。





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