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    熒光定量PCR檢測方法的建立(博迅搖床使用)

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-12-17 09:46【

    大腸埃希氏菌(Escherichia coli)通常稱大腸桿菌,在 一定條件下可以引起人和多種動物發生胃腸道感染或尿 道等多種局部組織器官感染,是人體內較為常見的食源性 致病菌。近年來,因大腸桿菌污染水或食物造成人類食物 中毒的例子日益增多,該污染物給飲用水水質帶來了極大 的安全隱患。中華人民共和國國家標準《生活飲用水水質 衛生規范》規定,總大腸菌群及糞大腸菌群每 100mL 水樣 中不得檢出。因此,實現水質大腸桿菌的快速檢測顯得尤 為重要。


    1 材料與方法 


    1.1 材料 


    1.1.1 實驗材料


     大腸桿菌 E. coli BL21、E. coli TG1 均由本實驗室保 存并提供。 


    1.1.2 試劑


     pTA2 載體購自上海捷瑞生物公司,基因組提取試劑 盒、割膠回收試劑盒、質粒 DNA 小量提取試劑盒等均為上 海莊盟生物科技有限公司的產品。NaCl 為無錫市東昌化學 試劑有限公司產品,瓊脂粉、瓊脂糖、蛋白胨、酵母提取物 等化學試劑均購于上海澤衡生物技術有限公司。10×PCR buffer,MgSO(4 50mmol/L),dNTPS(2.0mmol/L),Taq 酶,50% DMSO,2×SYBR premix Ex-Taq 等均購于 TOYOBO 公司。 uida 基因片段相關引物均由上海生工生物技術有限公司 合成。 


    1.1.3 儀器


     臺式高速冷凍離心機(德國西格瑪有限公司,Sigma 3K-15);水平電泳系統(北京市六一儀器廠,DYCP-31D);恒溫培養箱(太倉精宏儀器設備有限公司,JINGHONG);恒 溫搖床(上海博迅實業有限公司,DSHZ-300A);電泳成像 系統(上海天能科技有限公司,Tanon-2500);超凈臺(蘇州 凈化設備有限公司,SW-CJ-IF);水浴鍋(太倉精宏儀器有 限公司,JINGHONG);熒光定量 PCR 儀(德國耶拿分析儀 器股份公司,MiniOpticon);紫外-可見分光光度計(上海滬 粵明科學儀器有限公司,TU-1900);圖像分析系統(Tanon, Image master VDS)。 


    1.2 方法 


    1.2.1 大腸桿菌 E.coli BL21 菌基因組提取


     BL21 菌液培養至測到菌液吸光值為 OD=0.2-0.6 時, 根據上海莊盟生物科技有限公司基因組提取試劑盒說明 書對 BL21 菌進行總 DNA 的提取。質粒 DNA 提取方法參 考小量質粒抽提試劑盒內說明書。提取后的質粒 DNA 用 紫外分光光度計測定其 OD260/OD280 的數值。 


    1.2.2 PCR 擴增大腸桿菌 uida 保守基因片段


     通過 GenBank 查找 uida 基因序列,通過 BLAST 比對 篩選出更為保守的基因片段約為 800bp,設計兩對 PCR 引 物(如表 1 所示),采用表 1 中的 uida-F/uida-R 引物,以大 腸桿菌基因組為模板,對大腸桿菌 uida 保守基因片段進行 常規 PCR 反應。反應體系共計 50μL,ddH2O 37.5μL,基因 組模板 1μL,10×PCR buffer 5μL,2mM dNTP 4μL,Taq 酶 (5U/μL) 0.5μL,上下游引物各 1μL。擴增反應程序如下: 94℃預變性 3min,94℃ 1min,56℃ 30s,72℃ 1min,30 個循 環進行延伸;4℃保溫 10min。反應結束后,取 5μLPCR 產物 進行 1%瓊脂糖凝膠電泳,再由割膠回收試劑盒割膠回收, -20℃保存。

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    1.2.3 標準品重組質粒構建


     將上述克隆的 uida 基因片段通過 TA 克隆方法與 pTA2 載體連接,反應體系如下:目的基因 7μL,pTA2 載體 1μL,T4 連接酶 1μL,T4 連接酶 buffer 1μL。16℃水浴連接 16h 后,將 uida 重組質粒轉化至 TG1 菌感受態細胞中,均 勻涂布到含氨芐的 LB 平板中,37℃培養 12-16h。挑取單菌 落培養過液后進行測序。抽提質粒進行 1%瓊脂糖凝膠電 泳鑒定,所獲得的重組質粒命名為 pTA2-uida。 


    1.2.4 熒光定量 PCR 條件優化


    熒光定量 PCR 引物采用表 1 中的 quida-F1/quida-R1 的引物,通過優化熒光定量 PCR 反應體中退火溫度,退火 溫度選擇在 55~65℃范圍內,以 1℃作為梯度進行優化。最 佳條件根據擴增曲線的 Ct 值和熔解曲線來判斷。


    2 結果與分析


    選取 5 個梯度(103 ~107 copies/μL)的標準重組質粒,進 行熒光定量 PCR 檢測,曲線呈現 S 型,表明 Ct 值與濃度存在良好的線性關系。由此,以模板濃度對數 值為縱坐標,Ct 值為橫坐標建立熒光定量 PCR 檢測 E.coli 的標準曲線。曲線回歸的標準方程為:Y=- 0.3823X+12.172(直線斜率 A=-0.3823,截距 B=12.172,X= 模板濃度,單位為 copies/μL),且曲線的相關系數 R2 >0.98, 說明可信度較高。重復性測定 107 copies/μL、105 copies/μL、 103 copies/μL 高中低三個梯度質粒模板 Ct 值,計算平均值和變異系數。 可知,隨濃度降低,擴增曲線的標準差逐漸 增大,變異系數則始終小于 1%,則說明在合 理的誤差范圍內,建立的水質熒光定量 PCR 方法重復性好。


    3 討論 


    大腸桿菌作為糞源性污染衛生細菌學 指標,在環境水質監測中起著非常重要的指 示作用。若水體中檢測出大腸桿菌則意味著 水質已被污染。分布在自然界的大腸桿菌 大多數是不致病的,主要附生在人或動物的 腸道里,為正常菌群,但少數的大腸桿菌具 有毒性,侵入人體時,可引起感染,如腹膜 炎、膽囊炎、膀胱炎及腹瀉等。對老人及小 孩的感染可能是致命性的。因此,我國在飲 用水方面的衛生標準限定 100ml 水樣中不 得檢測出大腸桿菌,該標準要求必須達到檢 出單個細菌的水平。




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