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    細胞增殖和凋亡的影響及其機制(博迅細胞培養箱

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-12-13 09:59【

    微小 RNAs (miRNAs)是一 類 由 18~25nt 組成的非編碼 RNA,可通過直接與靶基因的3′端 非翻譯區 (3′-UTR)相互作用調控靶基因的表達, 參與細胞的增殖、分化和凋亡等生物過程,與包括 食管癌在內的多種疾病的發生發展有密切關聯。 miR-302b-3p被證實在食管癌組織中表達下調,不 僅可通過靶 向 ERBB4、Irf2和 CXCR 參與 調 控 食 管癌的炎癥反應,還可通過靶向 ERBB4誘導癌細 胞凋亡和抑制細胞增殖;然而其 調 控 食 管 癌 細 胞增殖和凋亡的分子機制尚未見報道。上皮細胞轉 化序 列 2 (epithelialcelltransformationsequence 2,ECT2)基因被證實是一種重要的致癌基因,在 乳腺癌和肺腺癌等細胞增殖和凋亡過程中發揮重要作用。


    1 材料與方法 


    1.1 細胞、主 要 試 劑 和 儀 器


     人 食 管 癌 EC-109 細 胞和人正常食管上皮 HET-1A 細 胞 (美 國 ATCC公司)。胎牛血清 (蘭州民海生物工程有限 公司),RPMI-1640 培 養 基 (美 國 Gibco 公 司), 胰 蛋 白 酶、 二 甲 基 亞 楓、 噻 唑 藍 (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT) 試 劑 (美 國 Sigma 公 司 ),miR-302b-3p mimics/inhibitor及其 陰 性 對 照 片 段 (江 蘇 百 奧 邁 科 生 物 技 術 公 司), 青 鏈 霉 雙 抗 混 合 液 (美 國 Gemini公司),細 胞 周 期 蛋 白 D1 (CyclinD1)抗 體、細 胞 周 期 蛋 白 依 賴 性 激 酶 2 (recombinant cyclindependentkinase1,CDK2) 抗 體、ECT2 抗 體、Bcl-2 相 關 X 蛋 白 (Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨 酸 蛋 白 水 解 酶 3 (Cleaved cysteinylaspartate specificproteinase-3,Cleaved caspase-3) 抗 體、 β肌動 蛋 白 (β-actin) 抗 體 (武 漢 博 士 德 生 物 公司 ), 硝 酸 纖 維 素 膜 (nitrocellulose filter membrane,NC)(美國 Pierce公司),辣根過氧化 酶標記的二抗 (北京中杉金橋生物有限公司),報 告基因表達 載 體 (美 國 Ambion公司),二喹 啉 甲 酸 (bicinchoninicacid,BCA)蛋白 濃 度 測 定 試 劑 盒、電 化 學 發 生 (electrochemicalluminescence, ECL)試 劑 盒 (上 海 碧 云 天 生 物 技 術 研 究 所 ), LipofectamineTM 2000、實時熒光定量 PCR試劑盒、 cDNA 合 成 試 劑 盒 (美 國 Invitrogen 公 司 ), TRIzol總 RNA 抽提 試 劑 盒 (北京百泰克生物公 司),雙熒 光 素 酶 檢 測 試 劑 盒 (美 國 Promega公 司),細胞凋亡檢測試劑盒 (美國 BD 公司)。流式 細胞儀 (美 國 BD 公司),PCR 擴增 儀 (美 國 MJ 公司),UVP 凝膠圖象分析儀 (英國 GeneGenius 公司),CO2 細胞培養箱 (上海博迅醫療儀器有限 公司)。 


    1.2 細胞培養


     采用含有10%胎牛血清和雙抗的 RPMI-1640培養基于體積分數為5%CO2、溫度為 37℃、飽 和 濕度細胞培養箱中培養 EC-109 和 HET-1A 細胞。每隔2d更換新鮮培養液。待細胞 鋪滿瓶底 時,以0.25%胰蛋 白 酶 消 化 傳 代。收 集 生長良好的對數生長期細胞進行實驗。 


    1.3 細胞 分 組 和 轉 染 


    將 EC-109細胞 分 為 空 白 對照組 (未轉染)、miR-NC組 (轉染 miR-302b-3p mimics陰 性 對 照)、miR-302b-3p 組 (轉 染 miR- 302b-3p mimics)、anti-miR-NC 組 (轉 染 miR- 302b-3pinhibitor陰 性 對 照) 和 anti-miR-302b-3p 組 (轉染 miR-302b-3pinhibitor),每組 設 3 個 復 孔。將 EC-109細胞以每孔500μL (約3×106 個) 接種至6孔細胞板上,培養箱內培養過夜。待細胞 貼壁生長 約 為75%融合 時,參 照 LipofectamineTM 2000說明書步驟將配制的脂質體 miRNA 混合物按 照實驗分組加入到 EC-109細胞中。轉染6h后更 換含胎牛 血 清 的 新 鮮 培 養 基。繼 續 培 養 48h 后, 收集各組細胞進行后續實驗。 


    1.4 實時熒光定量


     PCR 法檢測 HET-1A 細胞和 EC-109細胞 中 miR-302b-3p表達 水 平 收 集 未 轉 染的 HET-1A 細胞、EC-109細胞和轉染48h的各 組 EC-109細胞,采用 TRIzol法提 取 總 RNA,采 用分 光 光 度 計 測 定 RNA 的濃度和完整性。參照 cDNA 合成試劑 盒 說 明 書 步 驟 反 轉 錄 合 成cDNA。 以cDNA 為模板進行 PCR擴增。20μL反應體系: 2μLcDNA, 加 入 10μL2× 定 量 PCR Master Mix、各 0.08 μL 上 下 游 引 物 (摩 爾 濃 度 為20μmol·L-1)、0.4 μL Taq DNA 聚 合 酶 (2.5U·μL-1)和 6μLddH2O。PCR 反 應 體 系: 95 ℃ 預 變 性 3 min,95 ℃ 變 性30s、60 ℃ 復 性 30s,72℃延伸30s,共40個循環。miR-302b-3p 引物:F5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′,R5′- TGCTTAAGTGCTTCCATGTT-3′; U6 引 物: F5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′, R5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。 以 U6 為內參,采 用 2-△△Ct法 計 算 miR-302b-3p 的 相 對 表達水平。實驗重復3次。 1.5 MTT 法 檢 測 各 組 EC-109 細 胞 活 性 以 1000r·min-1離心 5 min 后收 集 各 組 EC-109 細 胞,調整細胞濃度為2×104 mL-1。以每孔100μL 平鋪于96孔細胞板上,每組設3個平行孔。置于 細胞 培 養 箱 內 常 規 培 養,分 別 在 培 養 24、48 和 72h后向每孔中加入10μL MTT (5g·L-1)溶 液孵育4h,并以100μL二甲基亞砜溶解 MTT 結 晶。采用酶標儀在450nm 波長處檢測各組細胞的 吸光度 (A)值,重復測量3次,取 A 值平均值表 示各組細胞活性。


    2 結 果


    食管癌 EC-109細胞中 miR-302b-3p的表達水平 (1.00±0.06)明顯低于正常食管癌上皮 HET-1A 細胞 (0.26±0.28) (t=4.476,P=0.011)。與 空白 對 照 組 比 較,miR-NC 組 和 anti-miR-NC 組 EC-109細胞 中 miR-302b-3p的表達水平差異無統 計學意義 (P>0.05);miR-302b-3p組 EC-109細 胞中 miR-302b-3p的表達水平較 miR-NC組明顯升 高 (P<0.05),anti-miR-302b-3p組 EC-109細胞 中 miR-302b-3p表達水平較anti-miR-NC組明顯降 低 (P<0.05)。見


    3 討 論


     腫瘤發生發展過程中往往伴隨著某些 miRNAs 的異 常 表 達,而 這 些 miRNAs在 腫 瘤 細 胞 增 殖、 侵襲、轉移和凋亡過程中發揮重要作用;其中, 作為 miR-302 基 因 簇 家 族 中 的 重 要 代 表,miR- 302b在多種腫瘤的進程中扮演著重要角色。miR- 302b-3p在胃癌組織和細胞中表達水平下調,上調 其 表 達 可 通 過 靶 向 胰 島 素 樣 生 長 因 子 1 受 體 (insulin-likegrowthfactor-1receptor,IGF-1R)抑制 AKT 信 號 通 路 的 激 活,影響周期相關蛋白 CyclinA2、CyclinD1、CDK2、CDK6 和 凋 亡 蛋 白 Bax、Bcl-2的表 達 發 揮 抑 制 細 胞 增 殖、細 胞 周 期 G1→S轉化并誘導細胞凋亡的作用。同時,miR- 302b 還 可 通 過 靶 向 調 控 EphA2 減 弱 Wnt/ β-catenin/EMT 信號 級 聯 通 路 抑 制 胃 癌 細 胞 的 增 殖、侵 襲 和 遷 移。在 惡 性 胸 膜 間 皮 瘤 細 胞 中, miR-302b通過靶向 Mcl-1抑制腫瘤細胞的增殖并 誘導細 胞 凋 亡。肝 癌 組 織 中 miR-302b 表 達 降 低,miR-302b過表 達 可 通 過 直 接 靶 向 Akt2 減弱 NF-κB和 MMP-2 的 表 達 抑 制 癌 細 胞 的 侵 襲 和 轉 移。此外,miR-302b還可 通 過 靶 向 調 控 E2F1 增強乳腺癌細胞對順鉑的敏感性,降 低 細 胞 活 性。可見,miR-302b可通過調控多種靶基因或 途徑調控腫瘤的發生發展。






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