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    冷藏草魚源氣單胞菌對生物膜形成的影響(SWCJ-2

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-12-06 09:56【

    草魚(Ctenopharyngodon idellus)肉質鮮嫩、營養豐 富,深受消費者的喜愛,是我國淡水養殖產量最高的魚 類,2017年產量高達534.56萬 t。水產品在貯藏、運輸 以及銷售過程中,常常由于幾種微生物的活動而導致腐 敗變質,這些微生物被稱為特定腐敗菌,是引起水產品 腐敗的關鍵因素。已有研究顯示氣單胞菌是冷藏草魚 的特定腐敗菌,草魚在4 ℃貯藏8 d時,氣單胞菌數量達 到8.49(lg(CFU/g)),占細菌比例的48.76%。氣單 胞菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陰性菌,最低生長溫度為 0~5 ℃,可以在低溫條件下與其他嗜冷菌競爭,因此在 冷藏水產品中常常檢出,魚類水產品中氣單胞菌的污染 率達31.9%。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    胰蛋白胨大豆肉湯(trypticase soy broth,TSB)、 Luria-Bertani(LB)肉湯、LB瓊脂、生理生化實驗試劑盒青島海博生物技術有限公司;結晶紫、乙醇 國藥 集團化學試劑有限公司; N - 丁酰基高絲氨酸內酯 (N-butanoyl-L-homoserinelactone,C4-HSL)、N-己酰 基高絲氨酸內酯(N-hexanoyl-L-homoserinelactone,C6- HSL) 上海甄準生物科技有限公司;細菌基因組DNA 提取試劑盒、2×EasyTaq PCR Supermix 全式金生物 技術有限公司;RP-18 F254S反相C18-薄層色譜板 德國 Merck公司。

    1.2 儀器與設備

    SHP-250生化培養箱 上海培因實驗儀器有限公司; HY-60振蕩搖床 武漢匯誠生物科技有限公司;LDZX40II型高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械公司;SWCJ-2FD 超凈工作臺 上海博迅實業有限公司;UV-1300 型紫外-可見分光光度計 上海美析儀器有限公司; Tanon-5200凝膠成像系統 上海天能科技有限公司; KH19A高速離心機 湖南凱達科學儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 細菌的分離

    冷藏草魚貯藏8 d(貨架期終點),隨機取出2 尾, 無菌條件下取腹部魚肉25 g,參照Wang Guangyu等的 方法分離氣單胞菌。挑取菌落數在30~300 CFU的平板, 對單菌落進行純化并保存。純化的菌株以W1、W2、 W3……進行命名。

    1.3.2 細菌的鑒定

    利用全式金細菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA, 然后擴增細菌的16S rRNA序列,將聚合酶鏈式反應 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送往生工生物工程 (上海)股份有限公司測序。測序結果利用NCBI數據庫 進行比對。 將分離的氣單胞菌屬細菌進行氧化酶、氨基酸、糖 類利用、七葉苷等生理生化實驗,在細菌種水平上進一 步鑒定。

    1.3.3 AHLs活性檢測

    平板劃線法:將待檢測菌株與報告菌株CV026在LB平 板上平行劃線,28 ℃培養18~24 h,觀察顏色變化。 報告平板法:利用報告平板法檢測細菌生長過程中 的AHLs活性變化。過夜活化的菌株W41和W69接種于 LB肉湯,每隔4 h取10 mL菌液,12 000 r/min離心10 min 后,獲得細菌上清液,將細菌上清液經0.22 μm微膜過濾除菌后,于-20 ℃保存備用。取過夜培養至對數期的紫 色桿菌CV026 2~3 mL,加入冷卻至40 ℃的含1.5%瓊脂 的LB中,混勻后傾倒平板。待平板凝固后,用無菌打孔 器在瓊脂中央打孔,加入50 μL不同培養時間的細菌上 清,于28 ℃培養24~48 h,用游標卡尺量取紫色區域直 徑,直徑越大表明AHLs濃度越高。

    2 結果與分析

    利用分子生物學方法,對20 株細菌進行16S rRNA擴 增,獲得的序列經NCBI數據庫進行BLAST比對,結果 顯示均為氣單胞菌屬(Aeromonas)。生理生化實驗結果 (表1)顯示,本研究分離的氣單胞菌氧化酶反應均為陽 性,均不能利用鳥氨酸和阿拉伯糖,而均具有利用葡萄 糖產酸的能力,但是相同種水平的細菌在精氨酸、賴氨 酸、七葉苷、水楊苷等的利用上存在差異。Abbott等的 研究也顯示氣單胞菌屬在種水平的鑒定比較困難,傳統 的生理生化反應多有重疊,很難明確區分,而且鑒定的 實驗方法也不一致。結合16S rRNA結果,本研究分離的 氣單胞菌屬包括殺鮭氣單胞菌(A. salmonicida,7?株)、 嗜水氣單胞菌(A. hydrophila,5?株)、中間氣單胞菌 (A. media,3?株)、A. rivuli(3?株)和A. molluscorum (2?株),其中嗜水氣單胞菌包含多個亞種。

    利用結晶紫染色法半定量檢測氣單胞菌的生物膜 形成情況,因為葡萄糖促進細菌生物膜的形成,所以在 初步檢測細菌的生物膜形成能力時,采用含有葡萄糖的 TSB肉湯進行培養。參考Stepanovic等的方法,將空 白孔A590 nm值的3?倍標準差作為臨界cut-off值,根據A590 nm 值將細菌分為以下幾類:A590 nm≤0.20,弱生物膜形成能 力;0.20<A590 nm≤0.80,中等生物膜形成能力;A590 nm> 0.80,強生物膜形成能力。

    3 結 論 

    檢測了冷藏草魚源分離獲得的20 株氣單胞菌 Aeromonas spp.的群體感應現象和生物膜形成情況,有 18 株氣單胞菌可以產生AHLs信號分子,20 株菌均顯示 有不同強弱程度的生物膜形成能力。以生物膜形成能力 較強的2 株菌A. salmonia W41和A. salmonia W69為主要對 象,結果表明2 株菌的AHLs活性具有菌體密度依賴性, 該2 株菌主要產生C4-HSL和C6-HSL信號分子,AHLs對 細菌的生物膜形成能力影響不同,其中高濃度C6-HSL 促進A. salmonia W41生物膜的形成;而高濃度AHLs降 低了A. salmonia W69的生物膜形成,低濃度AHLs促進 A. salmonia W69生物膜的形成。本研究顯示大多數草魚 源氣單胞菌可以產生群體感應信號分子,并且AHLs可以 影響氣單胞菌生物膜的形成情況,為水產品保鮮劑的開 發提供一定的理論支持。



     


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