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    小菌蟲腸道可培養細菌的分離鑒定(YXQ-50SII使用

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-12-05 11:18【

    昆蟲腸道中存在多種細菌,有調控寄主生長發 育、影響寄主免疫、協助寄主消化食物等功能[1-3]。 特別對白蟻來說,其對食物中木質纖維素的降解要 依賴于自身酶系及其體內腸道微生物來共同完成[4]。 小菌蟲 (Alphitobiuslaevigatus)是 世界 性 分 布 的 儲糧害蟲,我國大部分地區均有分布[5],其 成蟲 體 長4.0~5.0mm,長橢圓形,黑褐色,有光澤,全 身密 生 黃 褐 色 短 毛, 觸 角 有 11 節, 棍 棒 狀, 自 第7節開始 向 內 側 擴 展 而 形 成 鋸 齒 狀。復 眼 較 小, 從側面看,復眼被頭部向后突出的側片所分割,其 最狹處約等于1個小眼面的寬度,鞘翅上有細毛與 刻點組成的縱點行。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1 供試蟲體

    供試小菌蟲來源于山東第一醫科 大學 (山東省醫學科學院)病媒生物與蟲媒病實驗室, 美洲大蠊共同飼養,飼養條件為溫度 (26±1)℃、相 對濕度 (60±10)%、光 照12∶12 (L∶D),提 供 兔飼料作為食料。

    1.1.2 主要儀器和試劑

    生物安全柜 (蘇州安泰空 氣技 術 有 限 公 司),PCR 擴 增 儀 (AppliedBiosys- tems公司),水 平電 泳 槽 (北 京 君 意 東 方 電 泳 設 備 有限公 司),培 清JS-680D 全 自動凝膠成像分析儀 (上海培清科技有限公司),博迅YXQ-50SII立式壓力蒸汽滅菌器 (上海博訊實業有限公司醫療設備廠),高精 度數顯 恒 溫 水 浴 鍋 (常州智博瑞儀器制造有限公 司),牛肉 浸 膏 (天津市英博生化試劑有限公司), 瓊脂、酪蛋白、剛果紅、臺盼藍、細菌基因組 DNA 提取試劑盒 (北京索萊寶科技有限公司),可溶性淀粉、溴甲酚紫 (天津市凱通化學試劑有限公司),聚 乙烯醇 (PVA)(上海源葉生物科技有限公司),羧 甲基纖維素鈉 (CMC)(青州市清泉纖維素廠),橄 欖油 (遼寧晟麥實業股份有限公司)等。

    1.2 方法

    1.2.1 培養基的配置

    牛肉膏蛋白胨培養基 (NA 培養基):牛肉膏1.5g,蛋白胨5.0g,NaCl2.5g, 瓊脂 10.0g,加 入 ddH2O 定 容 至 500 mL,調 節 pH 值為7.0~7.4,121 ℃高 壓滅 菌20min,在 超 凈臺里均勻倒入無菌9cm 培養皿內,厚度約4mm, 冷卻凝固后,存放于4 ℃冰箱,備用。產淀粉酶細 菌篩選培養基:在 NA 培養基 的 基 礎 上 加 入1g淀 粉作為篩選 底 物,另 加0.005%的 臺盼 藍 作 為 指 示 劑,121 ℃高壓滅菌20min,在超凈臺里均勻倒入 無菌9cm 培 養皿 內,厚 度 約4 mm,冷 卻凝 固 后, 存放于4 ℃冰 箱,備 用。產纖維素酶細菌篩選培養 基:稱取羧甲基纖維素鈉5.0g,硫酸銨2.0g,磷酸二 氫鈉1.0g,七水合硫酸鎂0.5g,氯化鈉0.5g,硝酸 鉀1.0g,蛋白胨0.5g,酵母膏0.5g,0.005%剛 果紅作 為 指 示 劑,ddH2O 定 容至1000 mL,調 節 pH 值為7.0,121 ℃高壓滅菌30min,在超凈臺里 均勻倒入無菌9cm 培養皿內,厚度約4mm,冷卻 凝固后,存放于4 ℃冰箱,備用。產蛋白酶細菌篩 選培養基:稱取酪蛋白10g,瓊脂10g,加ddH2O 定容至500mL,用 NaOH 調節pH 值為7.0~7.5, 121℃高壓滅菌20min,在超凈臺里均勻倒入無菌 9cm 培養皿內,厚度約4mm,冷卻凝 固 后,存 放 于4 ℃冰箱,備用。產脂肪酶細菌篩選培養基:在 NA 培養基中加入12%橄欖油乳化液、0.005%溴甲 酚紫,調節pH 值為8.0,121 ℃高壓滅菌20min, 在超凈臺里均勻倒入無菌9cm 培 養皿 內,厚 度 約 4mm,冷卻凝固后,存放于4℃冰箱,備用。橄欖 油乳化液的配制:橄欖油和0.02g/mL的聚乙烯醇 (PVA)以體積比1∶3的比例混合,60 Hz震蕩混 勻5~10min,得乳化液。

    1.2.2 樣品制備

    取 3 頭小菌蟲成蟲分別置于 2mL試 管 中,饑 餓 24h 后,移于無菌離心管 內, 進行體表消毒,首先 以75%酒 精浸 泡5min,重 復 2次后,再以無 菌 水 漂 洗3次,去 除 表 面 細 菌。在 無菌的環境下,用研磨棒充分研磨蟲體,得到腸道 細菌原液。設3組重復,分別進行涂板。

    1.2.3 小菌蟲腸道細菌的分離

    取上述研磨液,分 別稀釋為10-1、10-3和10-5濃度,各取100μL 在 牛肉膏蛋白胨培養基上涂布均勻,放于培養箱37℃ 培養24h。待 菌 生 長 后,通 過 菌 落 的 形 態 大 小 對細菌進行分離純化,分離純化得到單個菌株,去除 重復菌株,保存備用。

    2 結 果

    通過傳統分離培 養法,從小菌 蟲 腸 道 內 分 離 出 4 種 主 要 腸 道 細 菌, 編號 Xjc1、Xjc2、Xjc3和 Xjc4。經 細菌16SrDNA 序列 PCR 擴 增,電 泳 均 出 現 約 1500bp 的 條 帶 ,測 序 結 果 進 行 BLAST 比 對,并對 其 同 源 序列用 MEGA5.0軟 件以 N-J法 構建 系 統 發 育 樹。 結果表明 Xjc1和 枯 草 芽 胞 桿 菌 (Bacillussubtilis) 的同源性為99.30%,且分類在同一支上支持率為 99%;Xjc2和肺炎克雷伯菌 (Klebsiellapneumoni- ae)的同源 性 為98.23%,且 分類 在 同 一 支 上 支 持 率為99%;Xjc3和 Pseudocitrobacterfaecalis 同源 性為99.09%,且分類在同一支上支持 率 為 90%; Xjc4和高地芽胞桿菌 (Bacillusaltitudinis)的 同 源性為 98.13% 。表 明 Xjc1 為 枯 草 芽 胞 桿 菌,Xjc2 為 克 雷 伯 菌 屬 細 菌,Xjc3 為 Pseudoc- itrobacterfaecalis,Xjc4為芽胞桿菌屬細菌。

    3 討 論

    在小菌蟲腸道中分離到4種可 培養細 菌,分 別 是 枯 草 芽 胞 桿 菌、肺 炎 克 雷 伯 菌、 Pseudocitrobacterfaecalis和芽胞桿菌。其中,2種 芽胞桿菌屬細菌有產消化酶活性。枯草芽胞桿菌有 產纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶活性,芽胞桿菌僅有 產蛋白酶活性,但產酶能力低于枯草芽胞桿菌。昆蟲腸道細菌受外界環 境因素的影響,不同地域的同種昆蟲其腸道細菌的 組成結構是存在差異的,且取食是腸道微生物變化 的主要影響因素[8-9]。本研究僅在小菌蟲的腸道中分 離出4種可培養細菌,可能與小菌蟲長期飼養于實 驗室內有關,實驗室飼養環境穩定,食料單一,是 導致小菌蟲的腸道細菌組成結構相對簡單的主要原 因。另外,小菌蟲一直在糧食、飼料或其他腐敗物 中孳生,腸道中可能存在大量不可培養的厭氧細菌。 有研究表明,同為貯藏害蟲的黑粉蟲 (Tenebrioob- scurus)腸道中僅存在金桿菌屬 (Aureobacterium)、 李斯特 菌 屬 (Listeria)、微 桿菌 屬 (Microbacteri- um)、莫拉菌屬 (Moraxella)和短小桿菌屬 (Cur- tobacterium)等5個屬可培養細菌[10];同樣,黃粉 蟲 (Tenebriomolitor) 腸 道 細 菌 的 結 構 也 比 較 簡 單,可分離到放線菌屬 (Actinobacillus)、丙酸桿菌屬 (Propionibacterium)、檸檬酸桿菌屬 (Citrobacter)、 沙雷菌屬 (Serratia)、芽胞桿菌屬 (Bacillus)、皮桿菌 屬 (Dermabacter)、短狀桿菌屬 (Brachybacterium)、 棍狀桿 菌 屬 (Clavibacter)和 微小 桿 菌 屬 (Exig- uobcacterium)等9個 屬可 培 養 細 菌[11]。推 測貯 藏 害蟲的腸道可培養細菌的組成均比較單一,可能與 其遷移能力弱、食物單一有關。



     


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