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    蟬擬青霉提取液對小鼠的鎮痛作用

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-12-02 10:01【

    疼痛是指組織損傷或與潛在的組織損傷相關的 一種軀體感覺和情感經歷。鎮痛藥主要通過抑制中 樞神經系統和外周神經系統來發揮其鎮痛作用。 中樞性鎮痛藥(如阿片類)是與中樞中相關受體結合 產生鎮痛作 用,但 此 類 藥 物 多 具 有 成 癮 性。蟬擬 青霉(Paecilomycescicadae)為大 蟬 草 (Cordyceps cicadaeS-hing)的分生孢子無性型階段。蟬花是蟬 在土中的若蟲被蟬擬青霉寄生致死的帶菌尸體,在 其頭部長菌絲 形 成 的 孢 梗 束 似 花 蕾 故 名 蟬 花,由 于蟬花生長的地理位置、生態環境的不同,導致蟬花 的形態各異。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物

    SPF級昆明種小鼠,雌雄各半,體 重20g±2g,由中國人民解放軍陸軍軍醫大學提 供,許可證 SCXK(軍)2012-0011。雌雄 分 籠 在 室 溫為22℃±2℃,相對濕度在40%~60%的條 件 下 適應性飼養3d,給藥前禁食不禁水。

    1.1.2 試 驗

    菌 株 24 株 蟬 擬 青 霉 分 別 采 自 貴 州 (GZ)、四川(SC)、重慶(CQ)、云南(YN)、浙江(ZJ)、 海南(HN)、陜西(SX)、廣西(GX)及韓國(Korea)的 蟬花,經分離鑒定純化后保存于貴州大學真菌資源 研究所。

    1.1.3 主要試劑

    羅通定(含量>97%),大連美侖 生物技術有限公司;氯化鈉,天津市科密歐化學試劑 有限公司;冰醋酸(分析純),天津市富宇精細化工有 限公司;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na),天津市永大化 學試劑有限公司。

    1.1.4 主要儀器

    生化培養箱(HPD-150)、恒溫恒 濕智能搖 床(ZWY-C2112D),購自常州市華普教學 儀器有 限 公 司;超 凈 工 作 臺(BHC-1300IIA/B2),購自蘇州凈化設備有限公司;臺式低速離心機(TDZ5- WS),購自湘儀公司;可調高 速 勻 漿 機(FS-1),購自 常州國華電器有限公司;電子分析天平(FA2204Nd =0.0001g),購自 上 海 箐 海 儀 器 有 限 公 司;滅 菌 鍋 (GR60DA),購自廈門致微儀器有限公司;超純水機 (Exceed-Cc-24),購自成都艾柯水處理設備有限公 司;電熱鼓 風 干 燥 箱(GZX-9140MBE),購自上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

    1.2 方法

    1.2.1 培養基與試劑制備

    液體培養基:取葡萄糖 20.0g,蛋白胨3.0g,酵母膏2.0g,KH2PO41.0g, MgSO40.5g,超純水定容至1000mL,滅菌備用。 PDA 斜面培養基:馬鈴薯200g,葡萄 糖20g, 瓊脂20g,超純水定容至1000mL,滅菌,制成試管 斜面,備用。 35g/L羅通定的配制:精確稱取羅通定標準品 粉末3.5g,用10g/LCMC-Na溶液溶解定容至100 mL。 7mL/L冰醋酸溶液配制:精確量取冰醋酸0.7 mL,用滅菌超純水定容至100mL,現配現用。

    1.2.2 蟬 擬 青 霉 菌 絲 體 提 取 液 制 備

    參 照 譚 艾 娟方法制備。 菌種活化:將菌接種到 PDA 試管斜面上,25℃ 恒溫培養7d,備用。 種子培養:用 接 種 環 將 已 活 化 的 試 管 斜 面 菌 種 接種到裝有50mL 液體培養基的250mL的三角瓶 中,25℃、150r/min搖床振蕩培養72h~96h。 發酵培養:將種子培養液按 5%(7.5mL)的接種 量接種到裝有150mL液體培養基的500mL的三角 瓶中,25℃、150r/min搖床振蕩培養72h~96h。 不同濃度蟬擬青霉菌絲體提取液的配制:將上述 搖瓶培養好的菌絲4000r/min離心10min,去上清, 稱重,用玻璃勻漿器破碎細胞,分別按菌絲體:超純水 =4、8、16(g∶V)的 比 例,加 入 超 純 水 浸 提,然 后, 4000r/min離心10 min,取上 清 液,制 成 含 有1.25、 2.50、5.00g/kg的蟬擬青霉菌絲體提取液,備用。

    1.2.3 限量試驗

    參 照 徐 叔 云方法,取 小 鼠20 只,隨機分為2組,每組10只,雌雄各半。第1組為 蟬擬青霉組,一次經口給予0.2mL/10g的蟬擬青 霉菌菌絲體提取液,劑量為20.00g/kg;第2組為空 白對照組,經口一次 給 予 等 體 積 的 生 理 鹽 水。連 續 觀察14d,記錄染藥期間小鼠每天表現并于0、3、7、 14d稱重,試驗結束,后頸椎脫臼處死小鼠,剖檢,稱 取小鼠臟器重量,計算臟器系數(臟器系數=臟器質 量/動物質量×100%),并觀察病理變化。

    1.2.4 不同劑量蟬擬青霉菌菌絲體提取液的鎮痛作用觀察

    為了證明蟬擬青霉是否有鎮痛效果并確定 對比試驗的給藥劑量,選取24株中生長活性最好的 2株 YN-1和SC-4蟬擬青霉應用小鼠扭體法,考 察其菌絲體提取液不同劑量的鎮痛作用,取小鼠60 只雌雄各半,隨 機 分 為 5 組,每 組 12 只,陰性 對 照 組、陽性藥物對照組 和 高、中、低試驗組分別灌服等 量生理鹽水、35g/L羅通定和1.25、2.50、5.00g/kg 的蟬擬青霉菌絲體提取液,每 次 0.2 mL/10g, 1次/d,連續3d;于末 次 給 藥30 min 后,腹腔 注 射 0.7%冰醋酸,立即計時并觀察小鼠疼痛扭體反應的 潛伏期及產生扭體反應后15min內的扭體次數,按 下列公式計算鎮痛百分率。 鎮痛百分率=(陰 性 組 平 均 扭 體 次 數-給 藥 組 平均扭體次數)/陰性組平均扭體次數)×100%。

    1.2.5 不同來源蟬擬青霉菌株鎮痛作用對比研究

    對2.4的鎮痛結果分析,采用劑量為2.50g/kg,取小 鼠312只雌雄各半,隨機分為26組,每組12只,應 用小鼠扭體法對比考察24株蟬擬青霉菌菌絲體提 取液的鎮痛效果,以期篩選出具有顯著鎮痛作用的 蟬擬青霉菌株。

    1.2.6 統計學分析

    數據均采用“平均值±標準誤” 表示。數據均 采 用 SPSS統計 軟 件 進 行 處 理,進 行 方差統 計 學 分 析,P >0.05 表示 差 異 不 顯 著,P < 0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

    2 結果

    與生理鹽水組相比較,陽性藥物羅通定的潛伏 期延長(P<0.05)、扭體次數下降(P<0.01)和鎮痛 百分率最好。YN-1、SC-4的高中低劑量均能延長潛 伏期,其中 YN-1潛伏期延長作用明顯(P<0.05), 從對照組的4.24min延長至7.44min,超過羅通定。YN-1、SC-4菌絲體高、中劑量組均能顯著地 降 低 冰 醋酸所致小鼠扭體次數(P<0.05)(表3)。2株菌均 能較大程度提高鎮痛百分率,YN-1高、中、低組的鎮 痛百分 率 分 別 為 59.48%、63.22% 和43.10%;SC-4高、中、低組的鎮痛百分率分別為45.98%、55.75%和 40.23%。因此,2株蟬擬青霉菌菌絲體提取液均有 鎮痛作用,其中劑量組(2.50g/kg)鎮痛效果最好。

    3 討論

    化學刺激鎮痛模型中的醋酸致小鼠扭體模型, 主要是通過注射冰醋酸后,引起腹腔急性炎癥反應, 產生疼痛,作用部位在外周神經系統,用于考察外周 性鎮痛藥物鎮痛作用的藥物,操作簡便,結果可靠。 實驗數據表明具有較好鎮痛活性的菌株主要集中在 全國云貴川3個省份及韓國,而云貴川3個省相鄰, 氣候環境條件相似,證明蟬擬青霉的鎮痛活性會隨 著地形氣候的改變而改變。本研究中發現,24株蟬 擬青霉菌菌絲體提取液均有不同程度的外周鎮痛作 用,鎮痛百分率 在3.4%~64.8%之間,其 中 其 GZ-3、YN-1及 Korea-1的鎮痛效果較好,與羅通定相近 有很大的研究潛力。



     


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