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    咸鰳魚中微生物多樣性分析(博迅滅菌鍋使用)

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-11-27 10:09【

    咸鰳魚是浙東地區的傳統腌魚制品,因其肉質鮮 美且具獨特的“霉”香味而備受當地居民的喜愛。其加 工是以新鮮鰳魚為原料,不去除魚鱗、魚鰓及內臟,經 3 次加鹽腌制而成,加鹽量通常在 30 %~50 %。腌魚生 產過程實質上是一個復雜微生態體系在人為控制鹽 度、發酵溫度、濕度條件下,使微生物群落結構及功能 趨于人們期望的方向演化的過程。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    咸鰳魚:購于舟山、寧波、杭州蕭山水產品批發市 場,各采集 2 種樣品,依次編號為 A(腌制 90 d,25 ℃開 放腌制)、B(-18 ℃凍藏)、C(室溫 22 ℃攤放)、D(室溫 22 ℃攤放)、E(室溫 22 ℃攤放)、F(室溫 22 ℃攤放)。除 舟山市場采集的 A 樣品為商販自制咸鰳魚外,其余產 品均為東南亞進口咸鰳魚。 2216E 培養基:青島海博生物技術有限公司;DNA 提取試劑盒:北京莊盟生物科技有限公司;E.Z.N.A. R Stool DNA Kit、Taq DNA 聚合酶、DL2000 Marker:TaKaRa 寶成試劑有限公司。

    1.2 主要儀器

    超凈工作臺 SW-CJ-1CU、蒸汽壓力滅菌鍋 YXQSG46-280SA:上海博訊實業有限公司;高速冷凍離心 機 5810R:英國艾本德公司;超微量分光光度計 MN913、高速聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)儀 A24811:美國賽默飛世爾公司;凝膠電泳系統 Tanon EPS600、凝膠成像系統 Tanon 4200:上海天能科技有限公司。

    1.3 方法

    采集鰳魚鰓后部、背部及腹部肉,剪碎混勻。同種 樣品挑選體態大小一致、個體完整的 3 尾魚,將其魚肉 混勻,稱取 25 g 魚肉樣品至含 225 mL 生理鹽水的錐 形瓶中,震蕩混勻后制備梯度稀釋液,并涂布于 2216E 培養基。選擇適宜的稀釋度進行菌落計數,并隨機挑 取 40 個菌落,純化 2 次~3 次后,接種于相應的液體培 養基中,靜置培養 24 h~48 h,制備 30 %的甘油菌液, -80 ℃凍藏備用。取 2216E 肉湯活化好的菌液 2 mL,按照試劑盒說 明書操作,提取菌株基因組 DNA。參考袁開等方法, 對分離菌株 16S rDNA 序列進行擴增,擴增產物測序 工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成,基因序列 于 GenBank 中進行 BLAST 比對分析,部分序列結果提 交至 NCBI Genebank 數據庫。

    2 結果與分析

    采用 2216E 培養基對各樣品中可培養微生物進 行了計數與分離,咸鰳魚樣品在 2216E 培養基上的菌落數量集中分布于 4.9 log CFU/100 g~5.2 log CFU/100 g。 每組樣品隨機挑取 40 個菌落,經兩次純化后,從 A、C、 D、E、F 組樣品中共分離到 151 株可培養菌 (B 組樣品 微生物傳代后均未生長)。分離菌株經過提取基因組、 擴增獲得 16S rDNA 序列,測序結果經與美國國立生 物技術信息中心(National Center for Biotechnology In- formation,NCBI)數據庫比對分析,將其鑒定至種、屬 水平,具體結果見表 3。將部分序列提交至 Genebank 數據庫,獲取序列編號為 MK205156~MK205178。芽孢桿菌屬是一類廣泛分布在土壤和水圈中的 細菌,在海洋環境中有大量分布。市售咸鰳魚中的芽 孢桿菌屬細菌,可能來源于鰳魚自身的生存環境,也 可能在加工或保藏中混入。通常情況下,添加米飯等 淀粉質原料的發酵魚制品生產中,芽孢桿菌屬細菌會 成為優勢菌,并且具有較為豐富的多樣性。在高鹽 腌制海產品中,枯草芽孢桿菌僅可能少量存在于產品 中。A、D、E、F 組樣品中,枯草芽孢桿菌數量占據絕對 優勢。咸鰳魚加工原料中未加入淀粉質原料,且加鹽 量達魚體重的 30 %~50 %,因此,大量的芽孢桿菌可能 來源于生產后的貯藏或運輸中。

    3 討論

    基于分離培養研究技術從市售咸鰳魚中獲得 151 株可培養微生物,16S rDNA 序列分析顯示,分離菌株 可歸至 14 個屬和 23 個種。芽孢桿菌屬細菌是 A、D、 E、F 組樣品中優勢微生物;C 組樣品中葡萄球菌為優 勢菌,嗜冷桿菌和芽孢桿菌數量次之。上述 3 個屬以 外的其他種屬細菌在各類樣品中均呈零星分布的狀 態。然而,免培養高通量測序結果在屬水平上反映出 的微生物種類與分離培養方法不盡相同。Illumina MiSeq 測序結果顯示,C、D、E、F 組 中 狹 義 梭 菌 屬 (Clostridium sensu stricto)和分類梭菌科(Clostridiaceae unclassified)微生物數量最多是其中的主要優勢菌,而 A 組樣品中堿桿菌屬 (Alkalibacillus)、嗜鹽古生菌 (Natrinema) 幾乎占據了主導地位,B 組樣品則以慢性 芽孢桿菌屬(Lentibacilus)為主。



     


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