• <dl id="r2g8h"><menu id="r2g8h"></menu></dl>
    <sup id="r2g8h"><menu id="r2g8h"></menu></sup>
  • <div id="r2g8h"></div>
    <div id="r2g8h"><s id="r2g8h"></s></div>

    上海博迅官網

    服務熱線:17511683092
    021-58201756

    他們都在找: 博迅GZX-9070MBE電熱鼓風干燥 博迅BXM-30R立式壓力蒸汽滅 博迅YXQ-LB-50SII立式壓力蒸
    當前位置主頁 > 新聞動態 > 行業動態 >

    木瓜蛋白酶的失活機理研究(博迅GZX-9246MBE使用)

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-11-18 10:56【

    1 背景

    目前,紙塑鋁復合食品包裝材料是以食品專用紙 板為基料,由聚乙烯、紙、鋁箔等復合而成的紙質包 裝材料。因其包裝的便利性,紙塑鋁復合食品包裝材 料被廣泛應用于液態乳制品、植物蛋白飲料、果汁飲 料、酒類產品以及飲用水等領域,但原材料中的塑料 以及印刷油墨、膠黏劑含有的重金屬殘留物通常會遷移到包裝產品中,對產品造成污染并損害消費者 健康。此外,我國已經研發了多種以動植物為原料 的可食性包裝材料,并廣泛應用于各類食品包裝。但 環境污染致使動植物體內積蓄鉛、砷、鎘和汞等重金 屬,這也給可食性包裝材料的應用帶來了安全隱患。 因此,研究重金屬與生物大分子間的相互作用機理及 重金屬毒理分析,對拓展食品包裝材料的應用領域至關重要。

    2 實驗部分

    2.1 實驗試劑及儀器設備

    1)主要試劑 木瓜蛋白酶 [EC 3.4.22.2](生物試劑)、對氯汞 苯甲酸(化學純),美國 Sigma 公司;酪蛋白,生 物試劑,上海伯樂奧生物科技有限公司;三氯乙酸、 磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉,化學純,上海國藥集團化 學試劑有限公司;去離子水,實驗室自制。
    2)主要儀器與設備 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,DF-101S 型,河 南鞏義市予華儀器有限責任公司;電熱恒溫鼓風干燥箱,上海博迅GZX-9246MBE 型,上海博迅醫療生物儀器股份有限公司;電子分析天平,AL204 型,梅特勒 - 托利多儀器(上海)有限公司;同步輻射紫外真空 圓 二 色(synchrotron radiation circular dichroism, SRCD)光譜儀、同步輻射裝置(Beijing synchrotron radiation facility,BSRF)、4B8 真空紫外線站(vacuum ultraviolet,VUV),中國科學院高能物理研究所; 熒 光 光 譜 儀,LS-55 型, 美 國 珀 金 埃 爾 默 公 司; Materials Studio 材料模擬計算平臺,北京創騰科技有 限公司。

    2.2 實驗方法

    2.2.1 溶液的配制

    木瓜蛋白酶和對氯汞苯甲酸用 pH=7.0 的磷酸鹽 (phosphate buffered saline,PBS)緩沖液分別配成質 量濃度為 1 mg/mL 木瓜蛋白酶溶液和濃度為 1×10-4 mol/L 的 CMBA 溶液。 將 1 mL 的木瓜蛋白酶溶液與 1 mL CMBA 溶液 混合,放入 40 ℃集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中,調 節轉速為 150 r/min,攪拌 4 h,以形成均勻的混合物, 用于 SRCD 及熒光光譜測定。

    2.2.2 SRCD 分析

    測定參數設置如下:環境溫度 25 ℃,光徑 0.1 mm,儲存環的電子能量 1.5 GeV,束流強度 450 mA,分辨率 1.0 nm,掃描范圍 172~260 nm,停留時 間 1 min。每組樣品測定 5 次,取平均值,記錄數據。 2.2.3 熒光光譜分析 測定參數設置如下:環境溫度 25 ℃,激發波 長 280 nm,激發與發射的狹縫寬度均為 5 nm,掃 描速度 500 nm/min,掃描范圍 310~400 nm。每組樣 品測定 5 次,取平均值,記錄數據。所得數據通過 CDTool 軟件處理,并用 CDPRO 分析軟件計算蛋白 質的二級結構,CD 信號范圍為 -1.8×10-2 ~1.8×10-2 deg·cm2 ·dmol-1 ,蛋白質的相對分子質量為 110 Da。

    2.3 分子模擬

    CMBA 與木瓜蛋白酶(papain,PaP)分子對接 操作流程按進行。木瓜蛋白酶晶體結構來 自 Brookhaven 蛋 白 質 數 據 庫(protein data bank 編 號:1CVZ),利用 PyMOL 軟件除去木瓜蛋白酶晶 體結構中與受體結合的原配體分子 C48 和水分子,并對受體蛋白進行加氫加電荷處理。利用 Materials Studio 的功能模塊 Discovery 優化對氯苯甲酸 (4-chlorobenzoic acid,PCBA)和 CMBA 的空間三 維結構。利用 AutoDock 4.2 中 AutoGrid 和 AutoDock 兩個程序對 PCBA、CMBA 與木瓜蛋白酶分子間的 相互作用進行模擬,并對其柔性受體與剛性配體間 的對接進行計算。對接時,受體大分子的格點盒子 大小為 60 nm×60 nm×60 nm,格點間距為 0.375 nm,盒子中心位于半胱氨酸(cysteine,Cys)25 的 巰基(—SH)上。運用 Lamarckian 遺傳算法與局部 能量搜索相結合,利用預設配置對剛性配體分子進行 精確對接,循環次數默認為 10 次。每次循環運算設 定為 100 次獨立對接實驗,且用半經驗勢函數作為能 量打分函數,通過計算確定配體分子在受體活性口袋 中可能的結合位置,并將對接結果進行成簇聚類分 析,其均方根(root mean square,RMS)在 2.0 Å 內 的對接結果歸為一簇。最終依據最低對接結合能和成 簇分析確定合理的木瓜蛋白酶與CMBA的結合模式, 獲得配體與受體蛋白的結合能量和對接作用模式圖, 計算氫鍵距離。

    3 結果與討論

    木瓜蛋白酶是一種重要的巰基蛋白,是由 212 個 氨基酸殘基組成的含 3 對二硫鍵的單鏈蛋白分子,其 一級結構中含 7 個 Cys 殘基,其中 6 個形成 3 對鏈 內的二硫鍵,另一個Cys25則作為活性位點的巰基。 木瓜蛋白酶具有典型的 α+β 折疊結構,由大小相當 的左右 2 個結構域構成,2 個結構域構成的裂隙為催 化活性中心,含有如下保守氨基酸殘基組成的催化 三聯體:Cys25- 組氨酸(histidine,His)159- 天冬 酰胺(asparagine,Asn)175。其中,左結構域(L域)由 10~111 和 208~212 氨基酸殘基組成,主要是 α螺旋結構,而右結構域(R- 域)由 1~9 和 112~207 氨基酸殘基組成,基本是 β- 折疊結構。SRCD 光 譜在光強度、偏振性和準直性方面均優于常規的圓 二色譜,尤其在 190 nm 以下短波長區域,能觀察 到更多細致的蛋白質二級結構。通過 CDPRO 中 SELCON3, CDSSTR 和 CONTINLL 三個軟件進行重 復擬合,確定最佳分析擬合軟件程序為 SELCON3。 SELCON3 軟件中選用的 IBasis6 算法可使實驗值與 計算值的均方根差和標準均方根方差皆小于 0.1,適用于木瓜蛋白酶二級結構模擬擬合。 遠紫外區(178~250 nm)是肽鍵的吸收峰

    4 結語

    利用 SRCD 和熒光光譜分析方法,結合 分子模擬技術研究了模擬生理條件下濃度為 1×10-4 mol/L 的 CMBA 對木瓜蛋白酶的作用機理。SRCD 和 Trp 熒光光譜分析結果表明,經 CMBA 處理前后木 瓜蛋白酶的構象和二級結構成分發生變化,一定程度 上揭示了 CMBA 作用下木瓜蛋白酶蛋白構象轉變的 機理。利用分子模擬研究 CMBA 和木瓜蛋白酶所形 成復合物的形態,利用成簇聚類分析判定兩者間的最 佳作用模式,進一步分析對接結果揭示了 CMBA 與 木瓜蛋白酶發生的相互作用,CMBA 與木瓜蛋白酶 活性中心 L- 域的 Gly66 和 Trp26 殘基間存在的氫鍵 和疏水作用,使 L- 域遭到破壞,導致 α- 螺旋結構 含量急劇降低,β- 結構含量增加,最終酶結構趨向 離散,天然構象遭到破壞,熒光猝滅,木瓜蛋白酶 失活。光譜表征分析和分子對接理論研究結果一致, 兩者相互補充,能夠從實驗和理論兩方面協同研究 CMBA 分子與木瓜蛋白酶之間的相互作用,為今后 進一步開展重金屬與生物大分子間的相互作用機理 提供一定的理論依據和參考。



     


    免責聲明:文章僅供學習和交流,如涉及作品版權問題需要我方刪除,請聯系我們,我們會在第一時間進行處理。


    比比先锋资源上口爱冰淇淋