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    人骨肉瘤U-2 OS細胞增殖的研究(博迅YXQ-50S11使用

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-11-15 10:52【

    骨肉瘤是起源于間葉組織的惡性腫瘤,患病人 群多集中在兒童、青少年、55 歲以上的中老年人。 骨肉瘤易發生在血運豐富的長管狀骨干骺端,早期 極有可能發生肺轉移,且發展迅速。目前的主要 治療方式為手術切除和化療相結合,但由于復發 和耐藥發生率較高,嚴重影響了術后預后。紫草 素屬于萘醌類物質,是紫草中主要活性成分,又稱紫草醌或紫草寧,因具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧 化、神經保護、心臟保護、傷口愈合等作用而被廣 泛報道,常用于治療結腸癌、肝癌、神經膠質瘤、 關節炎、哮喘、急性肺損傷等。但紫草素對人骨肉 瘤的抑制活性報道較少。本研究探索紫草素通過調 控內質網應激蛋白誘導人骨肉瘤細胞死亡的作用 及其機制。

    1 材料

    1.1 儀器

    BSA124S 分析天平(德國 Sartoruis 公司); BSC-1000ⅡA2 生物安全柜(上海博迅實業有限公司);HEPA Class100 型二氧化碳培養箱、Easy pure Ⅱ超純水儀、BiofugePrimorcentigge 型高速冷凍離 心機(美國 Thermo Fisher Scientific 公司);CKX41 倒置顯微鏡(日本 Olympus 公司);Accuri C6 流式 細胞儀(美國 BD 公司);SpectraMax Plus 384 酶標 儀(美國Molecular Devices公司);Mini-Protean Tetra 電泳槽、Mini Trans-Blot 轉印槽、ChemiDOC XRS+ 分子成像系統(美國 Bio-Rad 公司);上海博迅YXQ-50S11立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業有限公司); 化學發光儀(美國 Turner Designs 公司)。 


    1.2 試劑

    紫草素(批號 S827904)購自美國 Selleck Chemicals 公司,質量分數 99.03%;胎牛血清(FBS) (批號 1816937)、Lipofectamine 2000 轉染試劑購自 美國 Thermo Fisher Scientific 公司;RPMI-1640 培 養基(批號 AAF023615)購自美國 GE 生命科學; 細胞計數試劑盒(CCK-8)(批號 40203ES60)、細 胞凋亡試劑盒(批號 40302ES20)購自上海翊圣生物科技有限公司;人 ATF4(ab184909)、ATF6 (ab62576)、GRP78(ab108615)、IRE1α(ab124945)、 GAPDH(ab181602)單克隆一抗、辣根過氧化物酶 標記的羊抗兔 IgG 二抗(ab6721)均購自美國 abcam 公司;干擾 RNA 訂購于銳博生物科技有限公司; 質粒訂購于通用吉滿生物科技有限公司;海腎熒光素酶報告質粒(E2231)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(E2920)購自美國 Promega 公司。

    1.3 細胞

    人骨肉瘤 U-2 OS 細胞購自中國科學院細胞庫。

    2 方法

    2.1 細胞培養

    從液氮罐中取出凍存的人骨肉瘤 U-2 OS 細 胞,將凍存管立即放入 37 ℃水浴中,輕搖使其迅 速融化,解凍后的細胞置于離心機中 1 000 r/min 離 心 5 min,吸棄凍存液,加入 1 mL 溫熱的 RPMI-1640 完全培養基輕輕吹打,轉入培養瓶中,緩慢補加適 量完全培養基,輕輕搖動培養瓶形成單細胞懸液, 放入培養箱中(37 ℃、5% CO2 濃度、飽和濕度) 培養。待培養基顏色發生明顯變化后使用移液器吸 棄培養基,溫熱 PBS 潤洗 2 次后加入等體積新鮮培 養基,于相同條件下繼續培養,直至達到實驗所需 細胞匯合度。取匯合度為 80%~90%的生長狀態良 好的細胞,吸棄舊的培養基,加入 2 mL 溫熱 PBS 輕輕潤洗 2 次,然后加入 2 mL 溫熱的 0.25%胰蛋 白酶消化細胞,置于培養箱中孵育 2 min,取出放 置于顯微鏡下進行觀察,待細胞形態由貼壁狀態下 的梭形逐漸收縮變圓、間隙增大后吸棄消化液終止 消化,加入適量溫熱的新鮮完全培養基,接著用移 液器輕輕吹打貼壁細胞,使之脫落并處于單細胞懸 浮狀態,計數后取適量細胞分置于新的無菌培養瓶 內繼續培養或用于實驗。

    2.2 CCK-8 法檢測細胞增殖抑制率

    取處于對數生長期且狀態良好的 U-2 OS 細胞, 0.25%胰蛋白酶消化使貼壁細胞脫落,新鮮完全培104 /mL 的單細胞懸液,以 200 μL/孔的體積接種于 96 孔培養板中,置于 5% CO2 培養箱中 37 ℃孵育 過夜;棄舊培養基,加入等體積一系列濃度梯度 (0.156 25、0.3125、0.625、0.125、0.25、0.5、1、2、 4 μmol/L)紫草素培養基稀釋液,繼續培養 48 h 后, 于每孔加入 20 μL CCK-8 溶液,放入培養箱中繼續 孵育 4 h,酶標儀在波長為 490 nm 測定每個孔的吸 光度(A)值,計算不同濃度的紫草素對細胞的抑 制率。實驗重復 3 次,用 Graphpad Prism 5.0 軟件 計算紫草素對受試細胞株的 IC50 值。 抑制率=(1-加藥孔平均 A 值)/空白對照孔平均 A 值

    2.3 紫草素對 U-2 OS 細胞凋亡的影響

    取對數生長期的人骨肉瘤 U-2 OS 細胞,棄去 培養基,PBS 清洗 2 次,胰蛋白酶消化后,用新鮮 培養基收集細胞,計數,以 1×105 /mL 細胞密度接 種于 6 孔培養板中,每孔 2 mL,放入培養箱培養。 過夜待細胞貼壁,分別加入 0、1、2、4 μmol/L 紫 草素處理,繼續孵育 24 h 后,收集各孔細胞上清液, 并使用胰蛋白酶消化細胞,收集細胞置離心管中與 上清液合并,2 000 r/min 離心 5 min,棄上清,重 復一次。往離心管中加入預先配好的 100 μL 1× Annexin V Binding Solution,制成細胞懸液,并依 次加入 Annexin V-FITC 結合物和 Propidium Iodide (PI) Solution 各 5 μL,輕彈離心管混勻試劑,室 溫下避光培養 15 min。最后加入 400 μL 1×Annexin V Binding Solution,使用流式細胞儀進行檢測。

    2.4 紫草素對內質網應激蛋白的調控檢測

    取對數生長期的人骨肉瘤 U-2 OS 細胞,常規消化 后,用新鮮培養基收集細胞,計數,細胞以 5×105 /孔 接種于 6 孔培養板中,放入培養箱培養。過夜待細 胞貼壁,分別加入紫草素 0、0.5、1.0、2.0 μmol/L, 繼續孵育 24 h 后,收集細胞,加入預配制的含 PMSF 和蛋白酶抑制劑混合物的 Western、IP 細胞裂解液, 制備蛋白樣品,BCA 法測定蛋白濃度。制備 10% 的分離膠和 4%濃縮膠對蛋白樣品進行電泳分離, 轉 PVDF 膜,脫脂牛奶封閉 2 h,加入相應的一抗 (1∶1 000)4 ℃孵育過夜,HRP 標記的二抗(1∶ 10 000)常溫孵育 2 h,加入増強型化學發光液上機, 對內質網應激蛋白的表達進行檢測。

    2.5 內質網應激基因敲低和過表達對細胞活力的影響

    對數生長期的人骨肉瘤 U-2 OS 細胞調整濃度 為 2.5×105 /mL 后接種于 6 孔培養板中,于培養箱中孵育過夜,75 pmol siRNA 寡核苷酸或 4、8 μg DNA 質粒與 Lipofectamine 2000 試劑混合后轉染細 胞,6 h 換液,加入 0.4、0.8、1.6 μmol/L 紫草素繼 續孵育 48 h,使用 CCK-8 試劑盒檢測細胞活力。

    2.6 報告基因檢測

    將 ATF4 或空白質粒(3 μg)、GRP78 報告質粒 (3 μg)和海腎內參質粒(4 μg)均勻混合,用 Lipofectamine 2000 試劑對人骨肉瘤 U-2 OS 細胞進 行轉染,6 h 換液,加入 0.8 μmol/L 紫草素繼續孵 育 24 h,使用溫熱的 PBS 清洗 2 次,按說明書先檢 測螢火蟲熒光,再檢測海腎熒光,實驗結果用各孔 海腎熒光做參比進行校正。

    2.7 統計學方法

    采用 Graphpad Prism 5.0 統計軟件進行數據處 理,計量資料采用?x±s 來表示,統計方法采用獨 立樣本 t 檢驗或單因素方差分析。

    3 結果

    流式細胞術檢測發現,紫草素 0~4 μmol/L 作 用 24 h 能濃度相關性地誘導 U-2 OS 細胞凋亡,凋 亡細胞比例分別為 6.30%±0.29%、11.60%±3.21%、 42.70%±8.63%、71.29%±10.75%(與 0 μmol/L 劑 量組比較)。細胞活力實驗檢測顯示,紫草素能濃度相關性 抑制 U-2 OS 細胞活力,與對照組相比有統計學意 義(P<0.01)。與轉染空白質粒相比,轉染 ATF4 表達質粒可直接促進 U-2 OS 細胞死亡,隨著 ATF4 轉染劑量的增加,細胞活力進一步下降,結果有統 計學意義(P<0.01)。將 GRP78 啟動子序列后連接螢火蟲熒光素酶 基因,構建 GRP78 報告質粒,海腎熒光素酶作為參比進行報告基因檢測。結果顯示,單獨轉染 ATF4 質粒可促進 GRP78 基因的轉錄,紫草素可增強內 源性或外源性 ATF4 對 GRP78 基因的轉錄促進效 果。與第一組轉染了空白質粒的對照組相比,差異 有統計學意義(P<0.01)。

    4 討論

    青春期是骨肉瘤的發病高峰期,男性發病率高于女性,早期易發生轉移。現階段骨肉瘤的治療模式是:術前新輔助化療–手術切除–術后輔助化療。化療常用藥物有阿霉素、甲氨蝶呤、順鉑和異環磷酰胺,通過不同組合聯合用藥。對于腫瘤 的手術切除,目前更傾向于廣泛切除而非全間室切 除,并保留重要組織,以最大程度維持肢體功能。 該模式在有效降低骨肉瘤的轉移和復發同時還能 有效提高患者的生活質量。除了易發生肺轉移外, 骨肉瘤的治療過程還常被突如其來的化療耐藥性阻斷,因此遠期生存率低于 30%。為了改善骨肉 瘤患者預后和生存率,人們從多方面尋找解決辦法,開發新的治療策略,包括根據基因測序結果個體化用藥、放射治療、免疫療法和研究新的化療藥 物或耐藥逆轉劑等。

     


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