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    蟻獅纖溶活性蛋白的發現(博迅生化培養箱使用

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-11-14 10:44【

    0 引言

    昆蟲穴蟻(Myrmeleon sp),其幼蟲俗稱蟻獅, 屬脈翅目昆蟲。具有化瘀通竅、利水通便、退瘡 祛痰等療效,可用于治療骨髓炎、中耳炎、脈管炎 等。我國對蟻嶺幼蟲的研究可追溯到明朝,李 時珍在1578年撰寫的《本草綱目》中就記載了蟻 獅可入藥,其后的很多醫書也闡述了蟻獅作為中 藥對治療疾病的功效(周漢輝等,2000),近年來 對蟻獅藥用價值的深度開發仍在繼續。目前治 療心血管病的藥物多為人工合成的西藥,大多具 有難以克服的缺點和不良副作用,而天然藥物常 具低毒性無副作用的優點。因此利用蟻獅研發 治療和預防心血管病的新藥,前景極為廣闊。

    1 材料及方法

    1.1 原料與試劑

    蟻獅:購自野生活體金沙牛直銷店;磷酸二 氫鈉:天津市大茂化學試劑廠;磷酸氫二鈉:天津 市大茂化學試劑廠;硫酸銨:天津市福晨化學試 劑廠;三(羥甲基)氨基甲烷試劑:天津市大茂化 學試劑廠;鹽酸:西隴化工股份有限公司;氯化 鋇:上海山浦化工有限公司;乙二胺四乙酸二鈉 (EDTA):天津市大茂化學試劑廠;氯化鈉:天津 市大茂化學試劑廠;聚乙二醇10000:天津市大茂 化學試劑廠;D34mm透析袋:上海源葉生物技術 有限公司;氯化鉀:天津市大茂化學試劑廠;氫氧 化鈉:西隴化工股份有限公司;瓊脂糖:GENE COMPANGY;碳酸氫鈉:天津市大茂化學試劑廠; 磷酸二氫鉀:天津市大茂化學試劑廠;考馬斯亮藍G-250:上海藍季科技發展有限公司;牛血清蛋 白:北京索萊寶科技有限公司;尿激酶:中國食品 藥品檢定研究所;牛凝血酶:中國食品藥品檢定 研究所;牛血清蛋白:北京索萊寶科技有限公司; 無水氯化鈣:天津市大茂化學試劑廠;硫酸銅:天 津市大茂化學試劑廠;氯化鎂:天津市大茂化學 試劑廠;硫酸錳:天津市大茂化學試劑廠;氯化 鋅:天津市大茂化學試劑廠;十二烷基硫酸鈉 (SDS):天津市大茂化學試劑廠;乙二醇-雙-(2- 氨基乙醚)四乙酸(EGTA):上海展云化工有限公 司;L-半胱氨酸酸鹽一水:天津市大茂化學試劑 廠;巰基乙醇(βME):西隴化工股份有限公司;一 水合檸檬酸:天津市大茂化學試劑廠;甘氨酸:天 津市大茂化學試劑廠。

    1.2 儀器與設備

    JB-2型恒溫磁力攪拌器:上海雷磁新涇儀器 有限公司;AUY220電子分析天平:梅特勒-上海; 高速冷凍離心機:熱電(上海)科技儀器有限公 司;DHG-9076A型電熱型恒溫鼓風干燥箱:上海 精宏實驗設備有限公司;WFZ—UV-2000型紫外 可見分光光度計:尤尼柯(上海)儀器有限公司; 微量移液器:德國Eppendorf公司;博迅生化培養箱:上 海博迅實業有限公司。

    2 實驗方法

    2.1 粗蛋白的提取

    將蟻獅從沙子里揀出,洗凈,瀝干,稱量,冰 凍致死;研磨后,加入適量預冷PBS(pH 7.4)浸沒 勻漿,4℃浸提24h。取浸提液,4℃,10000r/min條 件下離心15min,去沉淀,合并上清液。采用硫酸 銨鹽溶液飽和度的方法,對所得蟻獅粗提液進 行分段鹽析,得到0~35%、35%~70%、70%~100% 的目的蛋白,收集沉淀。將各鹽析段沉淀分裝入 預處理好的透析袋中,先用雙蒸水透析4h,再用 Tris-HCl 緩沖液(pH 7.4)透析,透析過程中多次更換緩沖液,直至緩沖液用氯化鋇溶液檢測不出 白色沉淀為止。透析后加入聚乙二醇進行濃縮, 濃縮后將透析袋中待測液取出,分裝后置 4℃保 存備用。

    2.2 標準曲線的制定

    打開超凈工作臺,紫外照射 0.5h 后,放入已 準備好的纖維蛋白凝膠平板等實驗耗材,用孔徑 為0.6cm的已滅菌槍頭的較大一端在板上打孔并 提前做好標記。按標記的順序每孔依次按表2加 入不同濃度的尿激酶溶液各20μL,并留一孔加入 PBS溶液20μL作為陰性對照,待加樣完成后,小 心平移將平板取出,用保鮮膜包好,于 37℃恒溫 培養箱中孵育20h左右。到時間后取出平板,每 板倒入考馬斯亮藍染液約10mL進行染色,10min 左右,然后先用蒸餾水多次沖洗平板至蒸餾水無 色后,換用洗脫液沖,至溶圈清晰可見即可。用 刻度尺測量溶圈的垂直直徑,每孔測量兩次,取 平均值,計算出實驗所得溶圈的面積。

    2.3 纖溶活性的測定

    采用纖維蛋白平板法測定提取的蛋白粗提 液是否有纖溶活性。 纖維平板的制作:取 0.6g 瓊脂糖于錐形瓶 中,加入 72mLPBS 緩沖液滅菌后冷卻至 50℃左 右,再加入3mL牛血纖維蛋白原、120μL凝血酶, 迅速搖勻并倒平板,將倒好的平板 4℃保存備 用。檢測時取出平板,用 200μL 槍頭打孔后加 樣,放入 37℃恒溫培養箱培養 24h,再進行染色、 脫色,如有纖溶活性,即可觀察到藍色平板上的 透明溶圈。

    2.4 蛋白濃度的測定

    蛋白濃度測定使用BCA蛋白定量法,以牛血 清白蛋白(BSA)作為標準參照物。 稀釋BCA標準品:與待測蛋白樣品相一致的 稀釋液按表1稀釋BCA標準品。

    3 結論

    采用硫酸銨分段鹽析法分離提取出蟻獅纖溶活性蛋白,通過纖維平板法檢測,發現 0%~35%、35%~70%、70%~100%三個段的蟻獅的 粗蛋白都具有與 UK 相媲美的纖溶活性,甚至高 于 UK。蟻獅粗蛋白經一系列理化性質研究,結 果表明,最適溫度為37℃,最適pH為6。



     


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