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    分享枯草芽胞桿菌增殖中的應用

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-11-04 14:34【

    0 引 言

    蛋白胨(peptone)是由?、胨、肽和氨基酸組成 的水溶性混合物,是微生物生長發育和繁衍的重要 氮素營養 。隨著生物醫藥產業的快速發展和人們 對微生物發酵技術的重視,蛋白胨的用量逐年增大。 雖然蛋白胨的生產路線短、工藝簡單,但其貨源仍舊 比較緊張,價格昂貴。開發新的蛋白胨資源和研 究新的制備工藝意義重大。蛋白胨不僅可用于微生 物培養基制備,還是醫藥生產、商品檢驗、衛生防疫、 臨床化驗和疫苗、毒素等生物制品生產及菌種培養 分離與鑒別的重要生化試劑 。

    1 材料與方法

    1. 1 供試材料與主要試劑

    枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)為本實驗室保 藏菌種;瓊脂粉,上海山浦化工有限公司,生化級;牛 肉膏和胰蛋白胨,上海盛思生化科技有限公司,生化 級;酪蛋白,上海伯奧生物科技有限公司,生化級; NaOH、KH2PO4、NaCl、H2SO4、CuSO4、K2SO4、 Li2SO4、HCHO、Na2WO4·2H2O、Na2MoO4·2H2O、氨 基苯磺酸?α?萘胺、苯酚,國藥集團化學試劑有限公司,分析純;胃蛋白酶、堿性蛋白酶,廣西龐博生物工 程有限公司,生化級。

    1. 2 主要儀器與設備

    DK?98?11A 型電熱恒溫水浴箱,天津市泰斯特 儀器有限公司;UV ?2500 紫外可見分光光度計,日本島津;IRPrestige?21 島津傅立葉變換紅外光譜儀, 日 本 島 津 ;HERMLE Z323K 冷 凍 離 心 機 ,德 國 Hermle 公司;PHS ?3C 型 pH 計,上海雷磁儀器廠; AL204 分析天平,梅特勒?托利多;DF ?101S 集熱式 恒 溫 加 熱 磁 力 攪 拌 器,鄭 州 予 華 儀 器 制 造 有 限 公 司;上海博迅YXQ-50SII立式壓力蒸汽滅菌器;L550?臺式低速離心機,湘儀離心機儀 器有限公司;KDN ?08C 凱氏定氮儀,杭州托普儀器 有限公司。

    1. 3 試驗方法

    1. 3. 1 冷榨花生粕蛋白胨的制備工藝

    準確稱取脫脂冷榨花生粕 5 g 溶解于 250 mL 去 離子水中,用鹽酸調 pH 至 2. 0,加入 5% 的胃蛋白酶 (以底物為基準,3 000 U/g)并于 37 ℃攪拌條件下酶 解 200 min,定 期 監 測 其 水 解 度(degree of hydroly? sis,DH%)變化;水解完成后,將水解液用 NaOH 調 節 pH 至 8. 0,加入 2% 堿性蛋白酶(以底物為基準, 50 000 U/g),于 50 ℃攪拌條件下酶解 190 min,定期 監測 DH%;水解全部完成后將酶解液置于沸水浴 中 10 min 滅酶。冷卻至室溫后于 4 ℃,5 000×g 離 心 25 min,取上清液冷凍干燥,即冷榨花生粕蛋白胨 (cold?pressed peanut meal peptone,CPMP)。

    1. 3. 2 一般性狀檢查

    ①顏色、澄清度和沉淀檢查 準確稱取 1. 0 g 花生蛋白胨放入 50 mL 去離子 水中(100 mL 燒杯),加熱煮沸使其溶解。冷卻至室 溫后觀察溶液顏色、澄清度和沉淀 。結果判定標 準:顏色分為無色、微黃、淺黃、黃色、深黃、淺棕和棕 色;澄清度分為澄清、微混和混濁;沉淀分為無、微 量、少量和多量。以細菌胰蛋白胨為標準。
    ②堿性沉淀檢查 準確稱取 2. 0 g 花生蛋白胨,加入 100 mL 去離 子水于 250 mL 三角瓶中,用 0. 1 mol/L NaOH 調節 pH 8~9,121 ℃高壓滅菌 30 min,冷卻至室溫后觀察 溶液澄清度和沉淀情況 。
    ③磷酸鹽沉淀檢查 準確稱取 2. 0 g 花生蛋白胨、KH2PO4 0. 5 g,加入 100 mL 去 離 子 水 于 250 mL 三 角 瓶 中 ,用 0. 1 mol/L NaOH 調 節 pH 7. 4~7. 6,121 ℃ 高 壓 滅 菌 30 min,冷 卻 至 室 溫 后 觀 察 溶 液 澄 清 度 和 沉 淀 情況 。
    ④ pH 值測定 準確稱取 1. 0 g 花生蛋白胨,加入 50 mL 去離子 水,加熱煮沸后使其溶解,冷卻至室溫,用 pH 計測定 溶液 pH 值。

    1. 3. 3 蛋白胨化學指標測定

    水分含量測定根據 GB 5009. 3-2016 測定; 灰分根據 GB 5009. 4-2016 測定 ;總氮采取微量 凱氏定氮法測定 ;氨基氮含量采取甲醛滴定法測定 ;蛋白胨含量采取雙縮脲法測定 ;糖含量采取 苯酚硫酸法;亞硝酸鹽法采取氨基苯磺酸?α?萘胺試 液測定;磷含量采取比色法(測定波長 820 nm)測 定 。氯化鈉含量采取滴定法測定 。

    1. 3. 4 枯草芽胞桿菌增殖培養試驗

    Luria?Bertani 培養基(LB 培養基)配方:胰蛋白 胨 10. 0 g,酵 母 提 取 物 5. 0 g,NaCl 10. 0 g,用 950 mL 去 離 子 水 溶 解 后 用 5 mol/L NaOH 調 節 pH 至 7. 0,用 去 離 子 水 定 容 至 1 000 mL,121 ℃ 滅 菌 20 min,冷卻至室溫,備用。 將胰蛋白胨用含氮量相等的冷榨花生粕蛋白胨 (CPMP)代替(12. 0 g),其他操作步驟相同,制備得 到的培養基稱為冷榨花生粕蛋白胨培養基(CPMP 培養基)。將 37 ℃已活化培養 24 h 的枯草芽胞桿菌 菌種斜面全部轉移至 100 mL 無菌水中,用玻璃珠分 散均勻,并稀釋至 1×10-3,備用;無菌條件下用吸液 管吸取 1. 0 mL 菌液分別接種至 LB 培養基和 CPMP 培養基,裝瓶量為 100 mL(250mL 三角瓶),37 ℃培 養 36 h,定期監測培養液 pH 和 600 nm 條件下的吸 光值(A600 nm),以 LB 培養基培養的枯草芽胞桿菌作 為對照,評價 CPMP 培養基對枯草芽胞桿菌增殖的 影響。

    2 結果與分析 

    通常情況下,蛋白胨的顏 色 一 般 不 能 太 深,否 則 會 影 響 微 生 物 的 生 長 和 繁 殖 ,如果顏色較深,則需要進行脫色處理。研究 者用微生物發酵法發酵熱榨花生粕制備花生蛋白胨 時發現,熱榨花生粕蛋白胨顏色較深,呈淺棕色 , 主要是由于花生粕熱榨工藝使花生色素浸出較多, 高溫條件下的美拉德反應和焦糖化反應也加深了熱 榨花生粕的顏色 。在澄清度和沉淀檢測項中,冷 榨花生粕蛋白胨與蛋白胨標準品基本一致,均澄清 透明且無沉淀,全部溶解。作為一種重要的微生物 培養生物化學試劑,蛋白胨的澄清透明是首要標準, 因為在微生物培養過程中常需要進行微生物生長情 況的觀測,若蛋白胨溶液呈現混濁或有沉淀易導致 觀測結果的不準確 ;在 pH 檢測項中,冷榨花生粕 蛋白胨與蛋白胨標準品 pH 較為接近,均在 pH 7. 0 左右;堿性沉淀與磷酸鹽沉淀均未檢測到,能滿足微 生物的生長要求。蛋白胨在微生物生長或產物合成中主要是作為 提供氮源的營養基質,因此,含氮量是蛋白胨重要的 質量評價指標。高質量細菌蛋白胨總氮要求達到 14. 5% 以上,植物蛋白胨由于含糖量相對較高,其 總氮應不低于 8. 5% 。對冷榨花生粕蛋白胨進 行了總氮含量測定,結果為(15. 08±0. 49)%,表明 冷榨花生粕的總氮含量較高,有利于促進微生物的 生長,符合高質量生化試劑蛋白胨的質量要求。

    3 結論與討論

    參考《微生物培養基的制造與應用》和《中國生 物制品主要原輔材料質控標準》對蛋白胨進行質量 評價,結果顯示,冷榨花生粕蛋白胨顏色為淺黃色, 2% 蛋白胨溶液澄清透明,無沉淀,pH 呈中性,無堿 性沉淀與磷酸鹽沉淀,含水量為(4. 16±0. 35)%,灰 分 含 量 為(10. 35±1. 03)% ,總 氮 含 量 為(15. 08± 0. 49)%,氮基氮含量為(2. 503±0. 45)%,含糖量為 (2. 63±0. 14)%,不含亞硝酸鹽,磷含量為(0. 073± 0. 15)%,NaCl 含量為(0. 86±0. 02)%,符合生化蛋 白胨的質量要求。將冷榨花生粕蛋白胨與胰蛋白胨在枯草芽胞桿菌增殖培養時無顯著差異(p>0. 05)。


     


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