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    蠐螬對激光損傷兔血分析-博迅恒溫水槽使用

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-10-28 10:15【

    眼的血 - 視網膜屏障( Blood - retinal barrier,BRB) 包 括內屏障和外屏障。內屏障由血管內皮細胞之間的緊密連 接( 如粘連小帶和閉鎖小帶) 以及內皮細胞中少量的囊泡 構成; 外屏障由視網膜色素上皮細胞( Retinal pigment epithelium,RPE) 之間的緊密連接和色素上皮調節媒介運輸的 不對稱分布的蛋白質構成。由于眾所周知的激光特性 與眼組織結構特點的相互作用,在醫療上,眼科是第一個應 用激光作為治療手段的學科。

    1 實驗材料

    1. 1 實驗動物

    成年健康有色家兔 30 只,體質量 2. 0 ~ 2. 5 kg,雌雄不 限,由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供。動物合格證號: 醫動字第 20 - 003 號。

    1. 2 藥品及試劑

    1. 2. 1 主要藥物

    蠐螬酸性水解液制取方法: 蠐螬 400 g ( 湖南東潤聯合醫藥有限公司中藥材部) ,清洗 10 遍以上, 浸泡 1 晚,后洗至無臭味。加蒸餾水 5 kg,加 37% HCl 至 pH 值為 2。高壓蒸汽鍋( 哈爾濱松花江醫療器械廠) 蒸 2 h。紗布( 4 ~ 5 層) 過濾,溶液中加 40% NaOH 至 pH 值為 6. 5 ~ 6. 8。冷卻,隔水加熱,濃縮至 1600 mL( 1 mL 溶液 = 0. 25 g 生藥) 。裝瓶,壓蓋,蒸汽高溫滅菌,冷藏保存。

    1. 2. 2 主要試劑

    P75NTR 一抗( 武漢博士德生物工程有 限公司) 、TrkA 一抗( 武漢博士德生物工程有限公司) 、DAB 顯色試劑盒( 武漢博士德生物工程有限公司) 。

    1. 3 主要儀器及器械

    眼科手術顯微鏡( 蘇州醫療器械有限公司) 、眼底接觸 鏡( 蘇州醫療器械有限公司) 、YZ/3 三面鏡( 蘇州醫療器械 有限公司) 、YZ5F 裂隙燈照相機( 蘇州醫療器械有限公 司) 、裂隙燈顯微鏡( 蘇州醫療器械有限公司) 、AG204 型電 子天平( 上海梅特勒—托利多儀器有限公司) 、TD5 - Ⅱ臺 式離心機( 長沙平凡儀器儀表有限公司) 、SSW 型電熱恒溫 水槽( 上海博迅實業有限公司) 、721 分光光度計( 上海第三 儀器廠) 、LKB8800 超薄切片機( 瑞典 LKB 公司) 、多功能顯 微鏡( 西德 OPTON 公司) 、Olympus 光學顯微鏡( 日本日立 公司) 、石蠟包埋機( 日本日立公司) 、LeicaMPS30 照相系統 ( 德國 Leica 公司) 、Leica 石蠟切片機( 德國 Leica 公司) 、萊特 532 眼底激光治療儀( 法國光太公司) 。

    2 實驗方法

    2. 1 激光損傷血 - 視網膜屏障動物模型的建立

    參照王曉英、陳少軍等造模方法并加以改進。實 驗動物的準備: 激光照射當日用復方托吡卡胺眼藥水滴眼 2 次。

    2. 2 造模方法

    兔稱重,固定,20% 烏拉坦 1 g /kg 耳緣靜脈注射全麻, 將兔頭部固定于激光機前,三面鏡置于結膜囊內,以波長 532 nm 的倍頻 Nd: YAG 激光( 光斑直徑 50 μm,能量 110 mw,曝光時間 0. 15 s) 在視盤及有髓神經纖維下視網膜處 密集照射 40 個點,光斑緊鄰,最大間隔為 100 μm。光斑效 應為 3 級( 中度 ~ 重度) : 中心白較濃或更濃,激光能量作用于內核層。

    2. 3 動物分組及給藥方法

    30 只成年健康有色家兔隨機抽取 10 只( 20 只眼) 作 為正常組,其余 240 只( 40 只眼) 造成激光損傷血 - 視網膜 屏障模型,并隨機分成模型組、蠐螬組,每組 10 只( 20 只 眼) 。 造模后第 2 天開始給藥,正常組與模型組予 0. 9% 生 理鹽水灌胃,5 mL/kg,1 次/d; 蠐螬組予蠐螬提取液灌胃,5 mL/kg,均為 1 次/d( 相當于成人等效最大劑量) 。

    2. 4 標本采集方法

    連續灌胃 1 周后,各組隨機抽取 5 只兔進行標本的采 集和指標的檢測,各組剩余的兔繼續同法灌胃至第 2 周結 束,再行標本的采集和指標的檢測。

    2. 4. 1 眼球壁標本的采集

    實驗結束后,動物耳緣靜脈注 射空氣處死,立即沿角膜緣作標記后摘除眼球,生理鹽水沖 洗干凈,在冰生理鹽水中于角膜緣后 0. 5 mm 處剪開眼球 壁,去除眼前節組織和玻璃體,在手術顯微鏡下找到激光斑 所處視網膜,大于激光斑范圍約 3 mm 切除該處眼球壁,用 4% 多聚甲醛在 4 ℃固定。

    2. 4. 2 視網膜組織勻漿的采集制作

    將依同法摘除的眼 球壁在手術顯微鏡下剝離激光斑部位視網膜,用濾紙吸干 水分,電子天平稱其濕重,再用雙蒸水按照濕重∶ 體積 = 1 ∶ 19 配制成 5% 的視網膜勻漿液。

    2. 5 觀測指標及其方法

    2. 5. 1 眼底觀察及照相

    造模后即刻作眼底照相; 每日灌 胃前用直接檢眼鏡查看眼底,觀察眼底情況,光凝后 7 d、14 d 再次眼底照相。

    2. 5. 2 光鏡下 HE 染色觀察

    將已經 4% 多聚甲醛固定 12 h 的眼球壁修片,切取激光斑部位視網膜( 正常組切取 相應部位) ,再置于新的 4% 多聚甲醛固定液繼續固定,梯 度酒精脫水,石蠟包埋,切片,經蘇木素伊紅染色( HE) ,封 片后鏡檢,顯微攝影。

    2. 5. 3 神經營養因子受體蛋白( TrkA、p75NTR) 表達的免疫組化觀察

    采用 S - P 免疫組化法檢測視網膜組織的 TrkA、p75NTR 表達: 石蠟切片經常規二甲苯脫蠟,梯度乙醇 脫水后切片,3% H2O2 去離子水孵育 5 ~ 10 min,阻斷內源 性過氧化酶,根據需要對組織切片進行預處理,滴加兔來源 的一抗,37 ℃ 孵育 1 ~ 2 h,PBS 沖洗,2 min × 3 次,滴加山羊抗兔 IgG 抗體 - HRP 多聚體,37 ℃孵育 20 ~ 30 min,PBS 沖洗,2 min × 3 次,選用 DAB 顯色,蒸餾水充分沖洗,選擇 適當的 封 片 劑 進 行 封 片。陰 性 對 照 省 去 滴 加 TrkA、 p75NTR、一抗的步驟,陽性結果為棕黃色。用 HAIPS - 1000 高清晰彩色病理圖像測量系統計算面密度值( 目標面 積/統計場面積) 作為半定量參數,測量 TrkA、p75NTR 的表 達。

    2. 6 統計學方法

    所有實驗數據以均數 ± 標準差( 珋x ± s) 表示,用 SPSS 12. 0 進行統計學處理。先做方差齊性檢驗,方差齊者用單 因素方差分析及 LSD 多重比較。方差不齊者作 Tambane’ sT2 檢驗。

    3 結果

    造模后各組均有明顯激光斑,某些見出血灶,激光斑中 心顏色呈濃白色,周邊見淺色一圈光暈。7 d 后,蠐螬組激 光斑顏色變淡,中心見色素形成,且邊界清楚,可見少許玻 璃體混濁。14 d 后,蠐螬組激光斑部分轉化為瘢痕組織,范 圍較前明顯縮小。正常組: 視網膜組織結構 完整,層次清楚,細胞排列整齊。光感受器細胞內外節無變 性,內外核層細胞數目多,內外網狀層無水腫,神經節細胞 數目多無空泡樣變性,細胞數目多。

    4 討論

    中醫認為: 激光致血 - 視網膜屏障損傷主要是由于熱 灼陰津、熱灼血絡,氣津相關,氣能生津、化津、攝津,津能載 氣,若陰津虧耗,無以載氣,則氣失依附而氣散氣耗而致氣 虛; 氣生于精,精化為氣,陰精虧耗必致氣虛; 陰損耗氣而致 氣陰兩虛,氣為血帥,氣行血行,若氣虛運血無力,可致氣虛 血瘀。最終導致視網膜細胞的水腫、滲出、出血甚至壞死, 故治療常以益氣養陰、活血利水為原則。

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