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    產消化酶活性比較-博迅滅菌器使用

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-10-28 10:15【

    茶是由茶樹的嫩莖、葉加工而成,茶飲料具有 獨特風味和品質,以及抗衰老、抑菌、降 血 脂、減 肥等功效,是世界上除水之外消費最多的飲品。 一般將茶葉分為黑茶、紅茶、白茶、綠茶、烏 龍 茶 和黃茶等6大基本茶類,其中黑茶是我國獨具特色 茶類之一。普遍認為黑茶分為陜西茯磚 茶、廣 西 六堡茶、湖南安華黑茶和普洱茶等,但也有人將云 南普洱茶定義為后發酵茶,屬獨特種類。黑茶與后 發酵茶的加工均需要多種微生物的參與,以真菌為 主要發酵菌;茯磚茶的加工過程包括篩分、拼配、 汽蒸、渥堆、筑制、發花、干燥和 成 品 包 裝 等,經 過復雜工藝制成產品;普洱茶的發酵過程包括養 地、潮水、翻堆、降 堆、干 燥、渥 香、攤 涼 去 火 等 工藝流程加工而成;六堡茶的加工過程主要包括采 葉、攤晾、殺青、揉捻、渥堆、復揉、烘干、篩分、 蒸壓、陳化、出倉等流程。鑒于后發酵茶產地不同, 加工工藝不同,不同產地的主要微生物菌群也不相 同,而這些微生物菌群則影響著發酵后茶葉的風味 與品質。

    1 材料與方法

    1.1 供試茶葉

    云南普洱茶、廣州小青柑、廣西六 堡茶、湖南熙茯茶。

    1.2 主要試劑

    蛋白酶 K 購自 MerckKGaA 公司, 瓊脂糖購自法國 BIOWEST 公司,GoldviewⅡ購自 上海翊圣生物科技有限公司,氯仿購自北京化工廠, 瓊脂、Tris平 衡 酚、TrisBase (三 羥 甲 基 氨 基 甲 烷)、EDTA (乙二胺四乙酸)、SDS (十二烷基硫酸 鈉)、氯霉素、虎紅鈉鹽、酪蛋白、臺盼藍和剛果紅購自北京索來寶科技有限公司,氯化鈉 (分析純)、 無水乙醇 (分析純)、葡 萄 糖 (分 析 純)、可 溶 性 淀 粉和溴甲酚紫購自天津市凱通化學試劑有限公司, 羧甲基纖維素鈉購自青州市清泉纖維素廠,橄欖油 購自遼寧晟麥實業股份有限公司,聚乙烯醇購自上 海源葉生物科技有限公司。用于真菌分子鑒定的擴 增引物由華大基因合成,引物序列為ITS1 (5′-TC- CGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCC- TCCGCTTATTGATATGC-3′)。

    1.3 主要儀器

    生物安全柜,蘇州安泰空氣技術有 限公司;光照培養箱,上海新苗醫療器械制造有限 公司;PCR 擴 增 儀,AppliedBiosystems公 司;水 平電泳槽,北京君意東方電泳設備有限公司;培清 JS-680DJ全自動凝膠成像分析儀,上海培清科技有 限公司;YXQ-LS-立式壓力 蒸 汽 滅 菌 器,上海博迅實業有限公司醫療設備廠;高精度數顯恒溫水浴鍋, 常州智博瑞儀器制造有限公司;HNY-2102C 搖床, 天津市歐諾儀器儀表有限公司。

    1.4 實驗方法

    1.4.1 培養基 (液)的配制

    孟加拉紅培養基:蛋 白胨5g,葡 萄 糖 10g,磷 酸 二 氫 鉀 1g,硫 酸 鎂 0.5g,瓊脂20g,1/3000 孟 加 拉 紅 溶 液 100 mL, 氯霉 素 0.5 g, 加 入 ddH2O 定 容 至 1000 mL, 121 ℃高壓滅菌20min,備用。PDA 培養基:稱取 新鮮馬鈴薯200g,加熱煮沸,煮至土豆軟,過濾取 濾液,加入葡萄糖20g,瓊脂20g,加入ddH2O 定 容至 1000 mL,121 ℃ 高 壓 滅 菌 20 min,備 用。 PDA 培養 液:稱 取 新 鮮 馬 鈴 薯 200g,加 熱 煮 沸, 煮 至 土 豆 軟, 過 濾 取 濾 液, 葡 萄 糖 20 g, 加 入 ddH2O 定容至1000mL,取100mL三角瓶進行分 裝,121 ℃高壓滅菌20min,備用。產淀 粉 篩 選 培 養基 (200 mL 溶 液): 在 NA 培 養 基 的 基 礎 上,加入0.4g 可 溶 性 淀 粉 和 0.005% 的 臺 盼 藍,加 入 ddH2O 定 容 至 200 mL,加 入 NaOH 調 節 pH 至 7.0~7.5,121 ℃高 壓 滅 菌20min后 冷 卻 至60 ℃ 左右,在超凈工作臺中,分裝至直徑9cm 的無菌培 養皿中,冷卻凝固后4 ℃貯存,備用。產蛋白酶篩 選培養基 (200 mL 溶 液):稱 取 酪 蛋 白 4g,瓊 脂 3.4g,加入ddH2O 定容至200mL,加入 NaOH 調 節pH 至7.0~7.5,121 ℃高壓滅菌20min后冷卻 至60 ℃左右,在超 凈 工 作 臺 中,分 裝 到 直 徑9cm 的無菌培養皿中,冷卻凝固后4 ℃貯存,備用。產 纖維素酶篩選培養基 (200mL 溶液):稱取羧甲基 纖維素鈉1.0g,硫酸銨0.4g,磷酸二氫鈉0.2g, 硝酸鉀0.2g,酵母膏0.1g,七水合硫酸鎂0.1g, 蛋白胨 0.1g,NaCl0.1g,剛 果 紅 0.04g,加 入 ddH2O 定 容 至 200 mL,加 入 NaOH 調 節 pH 至 7.0~7.5,121 ℃高 壓 滅 菌20min后 冷 卻 至60 ℃ 左右,在超凈工作臺中,分裝到直徑9cm 的無菌培 養皿中,冷卻凝固后4 ℃貯存,備用。產脂肪酶篩 選培 養 基 (200 mL 溶 液):在 NA 培 養 基 中 加 入 12%橄欖油乳化液、0.005%溴甲酚紫,調節pH 至 8.0,121 ℃高壓滅菌20min后冷 卻 至60 ℃左 右, 在超凈工作臺中,分裝到直徑9cm 的無菌培養皿中, 冷卻凝固后4 ℃貯存,備用。橄欖油乳化液的配制: 橄欖油和0.02g/mL的聚乙烯醇 (PVA)以 體 積 比 1∶3混合,60Hz震蕩混勻5~10min,得乳化液。

    1.4.2 真 菌 DNA 提 取 液 的 配 制

    1 mol/L Tris- HCl (pH=8.0)10mL,0.5mol/LEDTA (pH= 8.0)20 mL,20% SDS 20 mL,5 mol/L NaCl 20mL,ddH2O 定 容 至 200 mL,調 節 pH 至 8.0, 121 ℃高壓滅菌20min后,常溫貯存。

    2 結 果

    真菌在 PDA 培 養基上進行培養,直至分純。在云南普洱茶中分離 出2種 真 菌,P1 為 籃 狀 菌 屬 (Talaromycessp.), P2為 籃 狀 菌 (T.variabilis);在 廣 州 小 青 柑 中 分 離出3 種 真 菌,Q1 為 阿 曲 霉 (A.amstelodami), Q2為煙 曲 霉 (A.fumigatus),Q3 為 繩 狀 籃 狀 菌 (T.funiculosus);在 廣 西 六 堡 茶 中 分 離 出 2 種 真 菌,L1為黑曲霉 (A.niger),L2為冠突曲霉 (A. cristatus);在湖南 熙 茯 茶 中 分 離 出 1 種 真 菌,X1 為謝瓦曲霉 (A.chevalieri)。其中,分 離 自 普 洱 茶 的 籃 狀 菌 屬 Talaro- myces.sp.產纖維酶活性能力最強,分離自 小 青 柑 的繩狀籃狀菌的產纖維酶活性能力次之 。 2.4.3 發酵茶中真菌產淀粉酶活性比較 在發酵茶 分離得到的真菌中產淀粉酶共5種,分別為普洱茶 中分 離 到 的 Talaromycessp.和 T.variabilis,小 青柑中分離到的煙曲霉和繩狀籃狀菌以及六堡茶中 分離到的冠突曲霉,統計學分析表明,不同真菌的 產淀粉酶活性差異有統計學意義 (F=36.602,P< 0.01)。其 中,普 洱 茶 中 分 離 到 的 籃 狀 菌 Talaro- mycessp.和小青柑中分離到的繩狀籃狀菌產淀粉酶 能力最強,普洱茶中分離到的 T.variabilis產淀粉 酶活性能力次之,六堡茶中分離到的冠突曲霉產淀 粉酶能力最差。

    3 討 論

    所用茶葉 中,普洱茶和小青柑屬普洱茶系,六堡茶和茯磚茶 屬黑茶系,但均可歸屬于后發酵茶。已有研究表明, 后發酵茶中的優勢菌群為真菌,而又以曲霉屬、酵 母、青霉屬、根霉、毛霉屬和冠突散囊菌等為主, 不同茶葉發酵工藝中的真菌菌群,可能是影響發酵 茶口感和品質的主要因素。普洱茶、六堡茶和茯磚 茶是發酵茶的典型代表,而在不同茶葉的發酵過 程中,其優勢微生物菌群也有不同,參與普洱茶發 酵的微生物主要以黑曲霉 為 主, 還 包 括 酵 母 (Yeast)、 青 霉 屬 (Penicillium)、 根 霉 (Rhizo- pus)、毛 霉 屬 (Mucor)等 真 菌;茯 磚 茶 中 優 勢 菌群主要以冠突散 囊 菌 (Eurotiumcristatum) 為 主;六堡茶 中 優 勢 菌 群 為 青 霉 屬 和 曲 霉 屬 真 菌; 其他發酵茶的優勢微生物以曲霉屬和散囊菌屬等真 菌為主。涇 陽 茯 磚 茶 中 的 優 勢 菌 種 為 冠 突 散 囊 菌,其發酵液具有抗氧化活性,且以產總超氧化物 歧化酶 T-SOD 為 主。茶葉中的真菌在發酵過程 中,還可以茶葉為基質產生多酚氧化酶、單寧酶和 纖維素酶等多種酶類。然而,不同發酵茶的 優 勢真菌比較及其在發酵過程中是否有產消化酶活性 的研究尚未見報道。

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