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    白血病細胞的生物學效應影響-超凈工作臺使用

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-10-24 09:59【

    急 性 淋 巴 細 胞 白 血 病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一種惡性血液系統腫瘤疾病, 也是兒童時期最常見的惡性腫瘤,占兒童惡性腫 瘤的 35%。ALL 的臨床癥狀主要表現為貧血、肝 脾腫大及免疫能力低下,對患者健康危害嚴重 。 ALL 的發病機理較為復雜,對其機理目前尚未完 全明確。

    材料和方法

    試劑及儀器

    TRIzol 試劑購自美國 Invitrogen 公司;胎牛血清購 自美國 Hyclone 公司;ECL 試劑盒購自武漢艾美 捷科技有限公司;增殖細胞核抗原(PCNA)、 Caspase 3、Cyclin D1 及 MMP-9抗體均購自美國 Cell Signaling 公司;PVDF 膜購自美國密理博公司; 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶 科技有限公司;BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上 海威奧生物科技有限公司;FACSCanto 流式細胞儀 購自美國 BD 公司;DYCZ-24A 型雙垂直電泳儀購自北京六一儀器廠;PCR 系統購自瑞士 Roche 公 司;超凈工作臺購自上海博迅醫療生物儀器股份有限公司;CO2 細胞培養箱購自上海精密儀器儀表 有限公司。

    臨床標本采集

    2018 年 5 月至 2018 年 11 月在本院確診的 ALL 患 兒 23 例,其中男 14 例,女 9 例,年齡 8.9 ±2.3 歲, 參照張之南主編《血液病診斷及療效標準》進行 診斷。患兒家屬均簽署知情同意書,且本研究經 醫院倫理委員會批準。患兒的骨髓樣本均在治療 前采集,以防止藥物對骨髓樣本的干擾。采集患 兒骨髓樣本 2 m1 后,置于含 K2EDTA 的抗凝管中, 加入 Ficoll 分離液進行密度梯度離心,以提取骨髓 單個核細胞(BMNC),置于液氮保存。 細胞培養及轉染 采用含 10% 胎牛血清、5 μg/ml 青鏈霉素的 RPMI 1640 培養液,置于 37 ℃、5% CO2 的保溫箱培養, 每 2-3 d 傳代 1 次。

    細胞轉染步驟

    將 BMNC 接種 至 24 孔 板, 分 為 對 照 組(Control 組),miR-221 陰 性 對 照 組(miR-221-NC 組)及 miR-221 轉 染 組(miR-221 組),待細胞培養至對數期,按照 Lipofectamine 2000 試劑盒說明書進行轉染操作, 并于 37 ℃、5% CO2 條件下培養。 ALL 細胞 miR-221 水平的 RT-PCR 檢測 各組細胞轉染后培養 24 h,采用 TRIzol 試劑盒提 取細胞總 RNA,檢測 RNA 純度后,通過逆轉錄試 劑盒合成 cDNA。按照 miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒說明書檢測 miR-543 水平,以 U6 為內參,miR221 上 游 引 物:5′-CTGACTGCGTCACTGC-3′; 下 游 引 物:5′-CTGACGTGCAGTGCAC-3′。U6上游 引物:5′-GCGTACTGCGTGCATC-3′;下游引物: 5′-GACACTGCAGTCACTC-3′。PCR 反應步驟為: 95 ℃ 2 min;然后 95 ℃ 30 s,62 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s, 共 32 個循環,采用 2- △△ Ct 法計算基因的相對水平。 miR-221 對 ALL 細胞活力影響的 MTT 法檢測 將對數期細胞接種于 96 孔板,每孔 150 μl,細胞 密度為 3×105 /ml,每組均設置 3 個復孔,按照要 求轉染后培養 1、2、3、4 和 5 d,然后每孔加入 15 μl 的 MTT 試劑, 37 ℃條件下培養 2 h,棄培 養液后每孔加入 100 μl 的 DMSO,采用酶標儀在 490 nm 處檢測各孔 OD 值。 miR-221 對 ALL 細胞的細胞周期影響的流式細胞 術檢測 各組細胞轉染后培養 24 h,用 PBS 清洗 3 次后,經 70% 預冷的乙醇固定 12 h 后,制成密度為 1×105 /ml 的細胞懸液,加入 150 μl PI 染液避光孵育 30 min, 采用流式細胞儀檢測細胞周期分布。 miR-221 對 ALL 細胞凋亡影響的流式細胞術檢測 將對數期細胞接種在 6 孔板,按要求轉染后培養 24 h,經 1×binding buffer 清洗 3 次后,制成密度 為 1×105 /ml的細胞懸液,加入 5 μl Annexin V-FITC 避光孵育 10 min,清洗后用 500 μl 的 1×binding buffer 重懸細胞,加入 5 μl 的 PI 孵育 20 min 后上 機進行細胞凋亡檢測 ALL 細胞侵襲、遷移能力的 Transwell 檢測 首先在 Transwell 上室均勻鋪 100 μl 的 Matrigel 膠 (細胞遷移實驗無此步驟),然后將各組細胞接 種于 Transwell 上室,每孔加入 100 μl,細胞數為 1×105 /ml,下室加入 500 μl 10%胎牛血清的培養 液中培養 24 h,取出小室后用棉簽拭去小室上層 膜上未穿模的細胞,經 4% 的多聚甲醛固定 4 h 后, 采用 0.5% 結晶紫染色,經 PBS 洗滌 3 次后,在電 子顯微鏡下隨機選擇 5 個視野拍照并計數。蛋白表達水平的 Western blot 檢測 收集各組細胞后經 RIPA 裂解液處理提取總蛋白, 經 BCA 法檢測蛋白濃度。每孔上樣 15 μg 蛋白, 經 10% SDS-PAGE 電泳分離后,采用濕轉法將分 離的蛋白轉至 PVDF 膜,并采用 5% 脫脂奶粉室 溫下封閉 2 h,加入經稀釋的 PCNA、Caspase 3、Cyclin D1 及 MMP-9 蛋 白 一 抗,4 ℃ 孵 育 過 夜, TBST 清洗 3 次后,加入 HRP 標記的二抗室溫孵育 2 h,使用 TBST 清洗 3 次后,經 ECL 試劑發光顯影, 拍照后采用 Quantity One 軟件分析條帶灰度值。 miR-221 靶向 Wnt 基因的熒光素酶報告基因實驗 檢測 利用 TargetScan 生物信息分析軟件預測 miR-221 與 Wnt 基因的結合片段,通過 PCR 技術將該片段擴 增后插入熒光素酶載體構建 Wnt 基因野生載體, 同時通過基因突變技術將該結合片段的部分核苷 酸隨機突變,用于構建 Wnt 基因突變載體。采用 脂質體轉染法將 miR-221 mimic 和 Wnt 基因野生載 體或 Wnt 基因突變載體共轉染 BMNC 細胞,每組 設置 3 復孔,置于 37 ℃、5% CO2 條件下培養 24 h, 按照雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書檢測熒光 素酶活性。 統計學分析 采用 SPSS 21.0 軟件處理數據,數據以均數 ± 標 準差表示,采用 t 檢驗分析數據,P< 0.05 示差異 有統計學意義。

    結 果

    轉染后各組 ALL細胞的 miR-221水平 miR-221 組的 miR-221 的表達水平顯著高于對照組 及 miR-221-NC 組(P< 0.05)(圖 1)。


    討 論

    ALL 是兒童時期較為常見的血液疾病,臨床癥狀 主要表現為免疫功能減弱、貧血、發熱及血小板 數量下降等 。在 ALL 治療過程中,由于需要長期的化療干預,往往會產生不良反應,對患兒健 康及生活也產生嚴重危害,有臨床研究發現,兒 童急性淋巴細胞白血病治愈率較低,且容易復發, 嚴重影響治療效果。有文獻報道,乳腺癌患者的腫瘤組織中 miR-221 水平顯著下降,這與患者預 后密切相關。miR-221 在肺癌、肝癌等多種癌細 胞中表達水平顯著下降,通過上調細胞中 miR-221 水平,可抑制癌細胞增殖及遷移。因此,需 進一步分析 miR-221 對 ALL 細胞抑制效果,以期 為提高患兒治療效果提供實驗參考。

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