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    萃取部位的抗腫瘤作用研究-HHS-11-2使用

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-10-22 10:04【

    近年來,惡性腫瘤的發病率和病死率均逐年上升, 癌癥已成為我國居民的第一位死亡原因,疾病負擔沉重 。目前,臨床上使用的抗腫瘤藥普遍存在治療窗窄、 藥品不良反應相對較大、采用沖擊療法易導致過量中毒 等問題。而研究發現,一些天然藥物能夠抑制腫瘤的 生長,對腫瘤的轉移和復發有一定的抑制效果,且對放 療、化療具有“增效減毒”的作用 ,具有較大的開發研究 價值。三脈菝葜(Smilax trinervula Miq.)為菝葜科菝葜 屬植物,主要分布于我國江西、浙江、福建等地,亦分布 于日本 。

    1 材料

    1.1 儀器

    MK-Ⅱ型酶標儀、3111 型二氧化碳培養箱(美國 Thermo Scientific 公司);TS100-F 型倒置顯微鏡(日本 Nikon 公司);RE-5205 型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀 器廠);DZF-6030B型真空干燥箱(上海一恒科學儀器有 限公司);HHS-11-2型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業有限公司);TDZ4A-WS型低速臺式離心機(長沙湘儀離心 機儀器有限公司);SW-CJ-2F 型潔凈工作臺(蘇州安泰 空氣技術有限公司);BS124S型萬分之一天平[奧多利斯科學儀器(北京)有限公司]。

    1.2 藥品與試劑

    三脈菝葜藥材于 2016 年 9 月份采自江西省宜豐縣 黃崗山墾殖場,由江西中醫藥大學黃慧蓮教授鑒定為百 合科植物三脈菝葜(S. trinervula Miq.)的根莖;DMEM 高糖培養基(美國 Hyclone 公司,批號:AAJ207791);胎牛血清(浙江杭天生物科技股份有限公司,批號: 20170124);MTT(批號:303HC510)、試驗用順鉑粉末 (批號:320B022,純度:≥98.5%)、胰蛋白酶-EDTA消化 液(批號:20170623)、青鏈霉素混合液(100×)(批號: 20170625)、二甲基亞砜(DMSO,批號:20180608)均購 自北京索萊寶公司;試驗用環磷酰胺粉末(上海阿拉丁 生化科技股份有限公司,批號:L1729054,純度:97%); 乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等試劑均購自國藥集團 化學試劑有限公司,均為分析純。

    1.3 動物

    健康SPF級KM小鼠,♂,體質量(20±2)g,90只, 由江西中醫藥大學動物實驗中心提供,實驗動物生產許 可證號:SCXK(贛)2018-0003。小鼠購入后,SPF級標準 飼養,飼養和實驗期間予以自由攝食和飲水,并觀察小 鼠飲食和毛發狀況。飼養和實驗期間的操作符合國家 科學技術部頒布的《實驗動物管理條例》。

    1.4 細胞株

    人肝癌細胞株HepG2、人肺癌細胞株A549、人乳腺 癌細胞株 MCF-7 和 MDA-MB-231、人宮頸癌細胞株 HeLa、人卵巢癌細胞株 HO-8910 以及小鼠肉瘤細胞株 S180均來源于中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫。

    2 方法

    2.1 三脈菝葜醇提取物及其各極性部位萃取物的制備

    稱取干燥的三脈菝葜根莖14 kg,切碎,用70%乙醇 加熱回流提取3次,每次1 h,過濾后合并濾液,減壓濃縮 至無醇味,得到三脈菝葜提取物總浸膏 740 g(得率: 5.286%)。取總浸膏675 g混懸于適量的蒸餾水中,依次 用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取,減壓濃縮后分別 得到三脈菝葜醇提物各部位萃取物浸膏:石油醚部位萃 取部位 5.5 g(得率:0.043%)、乙酸乙酯部位萃取部位 65.9 g(得率:0.516%)、正丁醇萃取部位 123 g(得率: 0.963%);并將余下的水液減壓濃縮,得到三脈菝葜醇提 物水層部位372.2 g(得率:2.915%)。

    2.2 待測樣品溶液的制備

    根據預試驗結果,分別稱取三脈菝葜醇提物浸膏 200 mg、醇提物石油醚萃取部位和醇提物乙酸乙酯萃取 部位浸膏各50 mg、醇提物正丁醇萃取部位浸膏100 mg 和水層部位浸膏 200 mg,置于 1 mL 不同量瓶中,用 DMSO溶解并定容至1 mL,得到不同質量濃度(均以浸膏量計)的母液:三脈菝葜醇提物為200 mg/mL、醇提物 石油醚萃取部位和醇提物乙酸乙酯萃取部位均為 50 mg/mL、醇提物正丁醇萃取部位為100 mg/mL、醇提物水 層部位為 200 mg/mL。取上述母液,用 0.22 μm 微孔過 濾器過濾后,置于4 ℃冰箱中保存,備用。臨用前,取適 量溶液用完全培養基(含1%青鏈霉素混合液和10%胎 牛血清的高糖DMEM培養基)稀釋到所需質量濃度。

    2.3 細胞培養

    從-80 ℃冰箱中取出各細胞株,將凍存管置于 37 ℃水浴鍋中水浴約1 min,完全解凍后,轉入含5 mL 完全培養基的離心管中,以1 000 r/min離心3 min,棄上 清液,加入6 mL完全培養基,置于37 ℃、含5%CO2培養 箱中培養,復蘇后24 h更換培養基,之后每2~3 d對細 胞進行一次傳代,細胞傳代2次以上可用于試驗。

    3 結果

    三脈菝葜醇提物及其不極性萃取部位對6種腫瘤細 胞的抑制作用均呈現明顯的量-效關系。其中以三脈菝 葜醇提物乙酸乙酯萃取部位對腫瘤細胞的增殖抑制作 用最強,對各腫瘤細胞的IC50在40~210 μg/mL之間,其 對 MCF-7 細胞的 IC50為 70.56 μg/mL,對 MDA-MB-231 細胞的 IC50為 83.58 μg/mL,對 HeLa 細胞的 IC50為 44.67 μg/mL,這提示三脈菝葜的抗腫瘤有效成分可能集中在 醇提物乙酸乙酯萃取部位。但與傳統的抗腫瘤藥物順 鉑相比,三脈菝葜醇提物及其各極性萃取部位對6種腫 瘤細胞的IC50均較高。

    4 討論

    采用 MTT 法,考察了三脈菝葜醇提物及其不極性萃取部位對人肝癌細胞株HepG2、人肺癌細胞株 A549、人乳腺癌細胞株 MCF-7、MDA-MB-231、人宮頸 癌細胞株HeLa和人卵巢癌細胞株HO-8910在內的共計 6種腫瘤細胞株的增殖抑制作用,初步篩選了三脈菝葜 醇提物的抗腫瘤活性部位。結果發現,三脈菝葜醇提物 乙酸乙酯萃取部位的細胞增殖抑制效果最強,呈現明顯 的量-效關系,并且三脈菝葜醇提物乙酸乙酯萃取部位 對人乳腺癌細胞 MCF-7(IC50 為 70.56 μg/mL)、MDAMB- 231(83.58 μg/mL)和人宮頸癌細胞 HeLa(44.67 μg/mL)的體外增殖表現出較好的抑制效果,這提示三 脈菝葜抗腫瘤活性成分可能集中在三脈菝葜乙酸乙酯 萃取部位。結合相關研究結果發現,三脈菝葜與菝葜科 其他屬植物的抗腫瘤活性部位相一致,但三脈菝葜醇提 物乙酸乙酯萃取部位對腫瘤細胞的抑制效果強于菝葜 科其他屬植物的乙酸乙酯萃取部位(IC50大多在 100~ 300 μg/mL 之間)。

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