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    白血病細胞的生物學效應影響-博迅超凈工作臺使

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-10-22 09:58【

    急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一種惡性血液系統腫瘤疾病, 也是兒童時期最常見的惡性腫瘤,占兒童惡性腫 瘤的 35%。ALL 的臨床癥狀主要表現為貧血、肝 脾腫大及免疫能力低下,對患者健康危害嚴重 。 ALL 的發病機理較為復雜,對其機理目前尚未完 全明確。microRNA 是一類存在于真核細胞中的 非編碼小 RNA 分子,可特異性的抑制某些 mRNA 的表達,從而對細胞的生長、凋亡等重要生理活 動產生作用 。

    材料和方法

    試劑及儀器

    TRIzol 試劑購自美國 Invitrogen 公司;胎牛血清購 自美國 Hyclone 公司;ECL 試劑盒購自武漢艾美 捷科技有限公司;增殖細胞核抗原(PCNA)、 Caspase 3、Cyclin D1 及 MMP-9抗體均購自美國 Cell Signaling 公司;PVDF 膜購自美國密理博公司; 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶 科技有限公司;BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上 海威奧生物科技有限公司;FACSCanto 流式細胞儀 購自美國 BD 公司;DYCZ-24A 型雙垂直電泳儀購自北京六一儀器廠;PCR 系統購自瑞士 Roche 公 司;超凈工作臺購自上海博迅醫療生物儀器股份有限公司;CO2 細胞培養箱購自上海精密儀器儀表 有限公司。 臨床標本采集 2018 年 5 月至 2018 年 11 月在本院確診的 ALL 患 兒 23 例,其中男 14 例,女 9 例,年齡 8.9 ±2.3 歲, 參照張之南主編《血液病診斷及療效標準》進行 診斷。患兒家屬均簽署知情同意書,且本研究經 醫院倫理委員會批準。患兒的骨髓樣本均在治療 前采集,以防止藥物對骨髓樣本的干擾。采集患 兒骨髓樣本 2 m1 后,置于含 K2EDTA 的抗凝管中, 加入 Ficoll 分離液進行密度梯度離心,以提取骨髓 單個核細胞(BMNC),置于液氮保存。 細胞培養及轉染 采用含 10% 胎牛血清、5 μg/ml 青鏈霉素的 RPMI 1640 培養液,置于 37 ℃、5% CO2 的保溫箱培養, 每 2-3 d 傳代 1 次。細胞轉染步驟:將 BMNC 接種 至 24 孔 板, 分 為 對 照 組(Control 組),miR-221 陰 性 對 照 組(miR-221-NC 組)及 miR-221 轉 染 組(miR-221 組),待細胞培養至對數期,按照 Lipofectamine 2000 試劑盒說明書進行轉染操作, 并于 37 ℃、5% CO2 條件下培養。 ALL 細胞 miR-221 水平的 RT-PCR 檢測 各組細胞轉染后培養 24 h,采用 TRIzol 試劑盒提 取細胞總 RNA,檢測 RNA 純度后,通過逆轉錄試 劑盒合成 cDNA。按照 miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒說明書檢測 miR-543 水平,以 U6 為內參,miR221 上 游 引 物:5′-CTGACTGCGTCACTGC-3′; 下 游 引 物:5′-CTGACGTGCAGTGCAC-3′。U6上游 引物:5′-GCGTACTGCGTGCATC-3′;下游引物: 5′-GACACTGCAGTCACTC-3′。PCR 反應步驟為: 95 ℃ 2 min;然后 95 ℃ 30 s,62 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s, 共 32 個循環,采用 2- △△ Ct 法計算基因的相對水平。

    結 果

    轉染后各組 ALL細胞的 miR-221水平 miR-221 組的 miR-221 的表達水平顯著高于對照組 及 miR-221-NC 組(P< 0.05)(圖 1)。

    轉染后 ALL 細胞增殖水平的變化 轉染 2、3、4 和 5 d 后,miR-221 組 BMNC 細胞增 殖水平顯著低于對照組及miR-221-NC組(P< 0.05) (圖 2)。

    討 論

    ALL 是兒童時期較為常見的血液疾病,臨床癥狀 主要表現為免疫功能減弱、貧血、發熱及血小板 數量下降等 。在 ALL 治療過程中,由于需要長期的化療干預,往往會產生不良反應,對患兒健 康及生活也產生嚴重危害,有臨床研究發現,兒 童急性淋巴細胞白血病治愈率較低,且容易復發, 嚴重影響治療效果 。乳腺癌患者 的腫瘤組織中 miR-221 水平顯著下降,這與患者預 后密切相關。miR-221 在肺癌、肝癌等多種癌細 胞中表達水平顯著下降,通過上調細胞中 miR-221 水平,可抑制癌細胞增殖及遷移。因此,需 進一步分析 miR-221 對 ALL 細胞抑制效果,以期 為提高患兒治療效果提供實驗參考。

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