• <dl id="r2g8h"><menu id="r2g8h"></menu></dl>
    <sup id="r2g8h"><menu id="r2g8h"></menu></sup>
  • <div id="r2g8h"></div>
    <div id="r2g8h"><s id="r2g8h"></s></div>

    上海博迅官網

    服務熱線:17511683092
    021-58201756

    他們都在找: 博迅GZX-9070MBE電熱鼓風干燥 博迅BXM-30R立式壓力蒸汽滅 博迅YXQ-LB-50SII立式壓力蒸
    當前位置主頁 > 技術支持 >

    蛋白酶介導黑變的結構基礎與酶學機制分析

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-10-18 11:29【

    近年來,隨著人們生活水平的提高,蝦類養殖 與海洋捕撈發展迅猛, 其中南美白對蝦已成為世 界三大養殖對蝦品種之一,然而由于保鮮技術 仍未能獲得實質性突破, 原料在冷藏和運輸過程 中的黑變現象十分突出。 黑變對消費者雖然不會 造成安全危害,但是會顯著降低產品市場價值。 研 究表明,蝦類黑變與微生物作用無關,而與其體內 多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)活力有關。 基于酶促褐變機理, 目前控制對蝦冷藏過程中的 黑變主要通過理化和生物方法,從階段上講屬 于末端策略, 而對蝦黑變是一個極其復雜的級聯系統。

    1 材料與方法

    1.1 試劑

    Fura-2/AM 熒光探針,Sigma 公司; 鼠源絲氨酸蛋白酶多克隆抗體, 上海酶聯生物科技有限公 司;二氨基聯苯胺,西安永屹生物技術有限公司; 甲醛(AR),廣州化學試劑廠;冰乙酸(AR),廣州化 學試劑廠;無水乙醇(AR),廣州化學試劑廠;三氯 甲烷(AR),衡陽市凱信化工股份有限公司;二甲 苯,廣東光華科技股份有限公司;蘇木精,中國醫 藥(集團)化學試劑公司;伊紅,國藥集團化學試劑 有限公司; 中性樹膠, 國藥集團化學試劑有限公 司。

    1.2 儀器

    Nikon80i 顯微鏡,日本尼康公司;MesoMR-60 低場核磁共振儀, 上海紐邁電子科技有限公司; RM2245 半自動轉輪切片機,徠卡儀器有限公司; D-37520 冷凍離心機, 上海柏辰生物科技有限公 司;JEM-2100F 場發射透射電子顯微鏡,日本電子 株式會社;BCD-166TNA 海爾冰箱,青島海爾股份 有限公司;DHG-9053A 電熱鼓風干燥箱, 上海一 恒科學儀 器 有 限 公 司;GZX-9070 數 顯 鼓 風 干 燥 箱 , 上海博訊實業有限公 司醫療設備廠 ; BSA224S 電子分析天平, 賽多利斯科學儀器 (北 京)有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品制備

    體長 12~15 cm 新鮮南美白對 蝦購自湛江市霞山水產品批發市場, 充氧保活運 輸至實驗室,選取色澤良好、肢體外殼完好、大小 一致的個體,置于冰塊中猝死,清水沖洗干凈后用 篩絹瀝干裝入保鮮盒中于 4 ℃冰箱冷藏。 在 120 h 儲藏期內,每 24 h 采用低場核磁共振對南美白對 蝦體內水分分布狀態進行測定, 之后取肝胰腺組 織進行組織化學樣品制備和觀察。

    1.3.2 組織化學樣品制備與觀察

    每隔 24 h 取 肝胰腺組織,超凈工作臺中參照 Li 等試驗方法 由代表性部位切取 5 mm×5 mm×2 mm 組 織 塊, Bouin’s 固定液中進行組織固定,固定結束后梯度 乙醇脫水,組織透明后石蠟包埋,5 μm 組織切片, 常規染色程序染色后光學顯微鏡觀察拍照。 透射 電鏡樣品制備與觀察在廣東醫科大學電鏡室完 成。

    1.3.3 低場核磁共振

    采用低 場核磁共振儀對南美白對蝦 4 ℃冷藏過程中的水 分狀態進行監測, 置于 15 cm 的核磁管中然后放入磁體箱中,質子檢測參數為共振頻率 23.3MHz, 磁體強度 0.5T±0.05T,線圈直徑為 60mm,磁體溫 度為 32 ℃,采用 T2 測試(CPMG 序列)程序對弛 豫譜圖進行分析,其參數分別為 P90(us)=21.50, P180 (us)=38.48, SW (kHz) =100, D3 (us) =0.1, TR(ms)=5 000,RG1=20, RG2=3, NS=8,TE= 0.4 ms,NECH=12 000; 采用斷面掃描程序對在體 水分狀態進行質子密度圖像掃描。

    1.3.4 Ca2+熒光標記與觀察

    以二 甲基亞砜為溶劑配制 7.5 mmol/L Fura-2/AM 作為 Ca2+負載試劑,分裝之后-18 ℃保存,用時將脫水 處理后的石蠟切片滴加 Ca2+負載試劑,加入 0.01% 小牛血清白蛋白協助 Fura-2/AM 負載, 然后加入 5 mmol/L 的 Hepes 液在 4 ℃終止負載,15 000 g 離 心 5 min 后將所得沉淀懸浮 于 3 mL Hepes 液,4 ℃下保存并在 2 h 內進行熒光測定。

    1.3.5 絲氨酸蛋白酶免疫組織化學分析

    絲氨酸 蛋白酶免疫組織化學參照進行。 組織 標本經常規石蠟包埋、5 μm 切片、二甲苯脫蠟、梯 度乙醇脫水處理后, 進行 0.01 mol/L 檸檬酸緩沖 液(pH=6.0)及微波抗原修復。 室溫下將玻片置于 10%山羊血清的濕盒中封閉 20 min, 之后在玻片 上滴加 SP 兔抗人多克隆抗體(1∶100),濕盒中 4 ℃ 冰箱內過夜,第 2 天室溫下于玻片上滴加二抗,然 后濕盒內孵育 10 min, 孵育完畢后檸檬酸緩沖液 沖洗玻片并進行二氨基聯苯胺顯色,蘇木精復染, 常規脫水,中性樹膠封片后顯微觀察拍照。

    2 結果與分析

    隨著冷藏時間的延長,肝胰 腺組織中肝小管有不同程度的破裂, 冷藏初期肝 小管結構完整,肝小管之間接觸緊密,排列規則, 肝小管內細胞緊貼肝小管內壁, 隨著冷藏時間的 延長肝小管逐漸呈現不同程度的破裂, 內壁細胞 也逐漸由肝小管脫落, 冷藏至第 5 天時肝小管完 全失去管狀結構,細胞呈彌散狀散落。在冷藏初期細胞骨架完整,各種成分區域化分布,然而隨著冷 藏的延續細胞骨架逐漸解體, 細胞內各種成分開 始呈隨機化分布, 冷藏第 4、5 天時已完全失去剛 性結構,胞內各種組分和細胞器充分接觸,使品質 劣變的酶促反應進一步加速,本結果在組織、細胞和亞細胞水平上為對蝦冷藏過程中因組織和細胞 骨架結構破損而引起的細胞及其組分的聚集遷移 提供了證據, 證明肝胰腺組織及細胞骨架解體為 SP 介導 ProPO 激活破除了結構障礙。

    3 結論

    組織化學和低場核磁共振研究表明, 南美白 對蝦冷藏過程中肝胰腺細胞結構發生漸進性解 體,自由水含量隨之顯著增加,在結構解體和自由 水加速向胞外遷移的過程中, 驅動 Ca2+和絲氨酸 蛋白酶由胞內向胞外遷移,激活 ProPO,從而觸發和加速黑變進程。

    比比先锋资源上口爱冰淇淋