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    博迅對抑制表皮葡萄球菌生物被膜的實驗研究

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-10-17 09:56【

    目前,隨著臨床插管、心臟支架、人工關節等醫 療器材的廣泛使用,因此而帶來的細菌生物被膜感 染也越來越多。然而,生物被膜的抵抗作用使抗生 素難以殺死膜內細菌,治療此類感染需要大劑量的 抗生素,從而極易導致細菌產生廣泛的耐藥性,為臨 床治療帶來困難。最終,臨床治療時只能通過更換 留置物來徹底解決此類困惑,以至于給患者造成巨 大的身心創傷及高昂的醫療費用。為此,本研究以 表皮葡萄球菌生物被膜模型為研究對象,采用試管 二倍稀釋法,進行體外抑菌活性實驗,觀察大蒜素聯 用后在抑制生物被膜生長及其相關基因 icaA 表達 的變化,研究中藥的抑菌作用,探討降低臨床細菌耐 藥率的新途徑。

    1 材料

    1. 1 實驗菌株

    由江西中醫藥大學附屬醫院中醫 外科住院患者傷口分泌物中分離得來。

    1. 2 主要試劑及儀器

    大蒜素注射液( 江蘇正大 天晴) ; 鹽酸環丙沙星注射液( 廣東環球制藥) ; 營養 肉湯培養基( 杭州天和) ; 普通細菌培養箱( 上海躍 進) 、全自動細菌鑒定和藥敏分析儀器 WalkAway - 96 ( SIEMENS,Germany ) 、二氧化碳細菌培養箱 ( SANYO,JAPAN) 、酶標儀( 北京普朗) 、QT - PCR 儀( ABI,美國) 、生物安全柜( 上海博迅醫療股份有限公司) 。

    2 方法

    2. 1 制備菌液制備

    0. 5 麥氏度( 1. 5 × 108 CFU / mL) 的細菌菌液,再稀釋 15 倍,將濃度調為 1. 0 × 107 CFU /mL,于 4℃保存備用。

    2. 2 試管二倍稀釋法

    將抗菌藥進行梯度二倍稀 釋后接種檢測菌,37℃孵育 24h 后,將肉眼可見的細 菌生物被膜孔的最低藥物濃度定為藥物的最低抑菌 濃度。分五組進行: A 大蒜素組,準備 10 支無菌試 管,加入大蒜素,從濃度 900μg /mL 開始對倍稀釋, 后分別加 50μL 表皮葡萄球菌菌液,使終液濃度為 5 × 105 CFU /mL; B 環丙沙星組,準備 10 支無菌試 管,加環丙沙星,從濃度 100μg /mL 開始對倍稀釋, 后分別加 50μL 表皮葡萄球菌菌液,使終濃度約為 5 × 105 CFU /mL; C 大蒜素 + 環丙沙星組,取 10 支試 管,加入大蒜素,從濃度 900μg /mL 開始對倍稀釋, 后分別加 50μL 表皮葡萄球菌菌液,使終濃度為 5 × 105 CFU /mL,37℃培養 6h 后,加入環丙沙星,使 1 ~ 10 試管濃度為 100 ~ 0. 195μg /mL 10 個梯度; D 陰 性對照組只加肉湯; E 陽性對照組只加肉湯及菌液;37℃培養 24h 后,觀察記錄各組 MIC 值。

    2. 3 藥物抑制細菌被膜的觀察

    分 A 環丙沙星 組、B 大蒜素 + 環丙沙星組; 取 96 孔板,每孔總量 200μL,菌液終濃度 5 × 105 CFU /mL,37℃ 孵箱培養 24h 后,加入藥物組,其濃度按 1. 3. 2 所得的 MIC 進 行,繼續培養 0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h,取相 應時間點實驗孔進行結晶紫染色,于 595nm 處測各 自 OD 值。

    2. 4 藥物處理

    QT - PCR 檢測基因 icaA、agr 的 表達 分 A 環丙沙星組、B 大蒜素 + 環丙沙星組; 每 孔總量 200μL,菌液終濃度 5 × 105 CFU /mL,37℃ 孵 箱培養 24h 后,加入藥物組,其濃度按" 1. 3. 2" 項下 所得的 MIC 進行,繼續培養 48h 后超聲震蕩取菌, 利用 QT - PCR 檢測生物被膜相關基因 icaA 的表達 變化。

    2. 5 統計分析

    應用 SPSS 20. 0 統計軟件,將所得 數據進行分析,符合正態分布且方差齊性的計量資 料,用均數及標準差描述,根據設計類型采用相應的 t 檢驗; 如不符合用四分位數和中位數描述,根據設 計類型采用相應秩和檢驗,P < 0. 05 有統計學意 義。

    3 結果

    單用抑制表皮葡萄球菌被膜時,MIC大蒜素 為( 28. 125 ± 3. 12) μg /mL,MIC環丙沙星 為( 3. 125 ± 0. 23) μg /mL; 兩者聯用時,MIC大蒜素、MIC環丙沙星 分別 為( 14. 063 ± 2. 30) μg /mL、( 1. 563 ± 0. 09) μg / mL,兩數據采用 t 檢驗分析后發現聯用前后 MIC 有 顯著差異( P < 0. 05) ,且明顯降低。

    在兩組藥物抑制 細菌被膜在 0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h 時間點 結晶紫染色后,于 595nm 處測定 OD 值。兩組藥物抑制細菌被膜在 48h 后超聲震蕩取菌, 利用 QT - PCR 檢測生物被膜相關基因 icaA 的表達 量變化。

    4 討論

    當今,隨著臨床插管、心臟支架、人工關節等醫 療器械的廣泛使用,由此帶來的細菌生物被膜 ( bacterial biofilm,BBF) 的感染也越來越多。BBF 是指細菌附于惰性材料后,繁殖、分化,并分泌多糖 基質將菌體包裹于其中克隆聚集纏繞形成的細菌聚 集體膜狀物,它通過產生細胞間脂多糖,保護細 菌不受抗菌藥物的抑制,從而逃避機體免疫,成為潛在感 染 源,最終引發感染的反復發作且難以控制。由此,BBF 的抵抗作用使抗菌藥物難以到 達膜內殺死細菌,導致臨床治療需要大劑量抗生素, 從而容易引起細菌產生廣泛的耐藥性,為治療帶 來嚴重的困難。最終,臨床上對此不得不更換留 置物來徹底解決此類問題,給患者帶來身心劇痛及 高昂的醫療費用。目前,表皮葡萄球菌是臨床常見 致病菌,也是引起 BBF 的常見細菌,表皮葡萄球 菌生物被膜形成而導致的各系統感染已成為臨床感 染難治性的重要類型之一。因此,探索新途徑治 療細菌生物被膜感染具有十分重要的臨床醫學意義。

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