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    脊髓損傷大鼠神經功能修復的影響分析

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-10-16 11:04【

    脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)具有致殘率 高、后期康復及生活負擔重等特點,骨髓間充質干細 胞(bonemarrowstemcells,BMSCs)作為種子細胞 定向移植可 促 進 SCI修 復 及 功 能 恢 復 已 得 到 廣 泛 的證實。但是,BMSCs定向移植后因細胞生長環 境改變、脊髓原發性損傷炎性反應以及脊髓損傷后 相關抑制性信號通路開放所致繼發性損傷導致移植 細胞出現凋亡、生長緩慢、分化抑制等難題。相 關文獻認為繼發性損傷所導致的病理生理變化對神 經功能恢復起決定性作用,而相關抑制性信號通路 開放所致趨 化 因 子 和 細 胞 因 子 的 活 化 正 是 SCI后招募、激活炎性細胞的扳機點,從而進一步加重 SCI 的繼發性損 傷。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物及分組

    選 取5只 周 齡 為3~4周、 體質量為100g健 康 雄 性 SD 大 鼠 用 于 BMSCs的 提取,選取80只周齡為8周、體質量300g雄性SD 大鼠用于制作模型。SD大鼠均為清潔級,由新疆醫 科大學動物飼養中心提供,本研究經新疆醫科大學 第一 附 屬 醫 院 動 物倫理委員會批準 (編 號: IACUC20161208-05)。將80只 大 鼠 根 據 不 同 實 驗 干預措 施 隨 機 分 為 SCI模 型 組、BMSCs移 植 組、 Fasdiual治療組、聯合治療組(20只/組)。

    1.2 試劑及儀器設備

    胎牛血清、低糖 DMEM 培 養基、PBS緩沖液、雙抗、0.5%胰蛋白酶(美國 Hy- clone公司);神經元性特異性烯醇化酶(NSE)抗體、 膠質纖維酸性蛋白(GFAP)抗體及四甲基異硫氰酸 羅丹明(TRITC)標記的羊抗兔IgG 抗體、二脒基苯 基吲哚(DAPI)復染液(武漢博士德公司),神經絲蛋 白(NF200)抗 體(北 京 博 奧 森 公 司)。超 凈 工 作 臺 (蘇凈安泰),高速離心機(美國 Thermo公司)倒 置 相差顯微鏡(CarlZeiss),恒溫培養箱(上海博迅醫療股份有限公司),圖像采集設備(feciaDM3000)。

    1.3 BMSCs的提取、培養、純化及鑒定

    無菌條件 下取出5只周齡3~4周、體質量為100g大鼠的雙 側股骨及脛骨,置 于5%雙 抗 的 DMEM 中,用 低 糖 DMEM 反復沖洗骨髓腔,反 復 吹 打 成 單 細 胞 懸 液, 清洗、離心細 胞2 次 去 除 肉 眼 可 見 的 雜 質 及 油 脂。 用含體積分數12%胎牛血清的 DMEM 制作單細胞 懸液接種于 培 養 瓶 中,置 于37℃、5% CO2 恒 溫 培 養箱中培 養,72h 首次換液棄去未貼壁的 懸浮細 胞,之 后 每 3 天 換 一 次 液,當 細 胞 生 長 至 80% ~ 90%時,進行胰酶消化傳代(1∶3傳代),第3代 細 胞已經去除非貼壁的骨髓造血干細胞,得到純化的 BMSCs,使用流式細胞計數進行檢測。移植前用毛 細吸管反復吹打分離細胞,制作單細胞懸液,PBS洗 滌2次,調整細胞密度為1×106 個/μL,移植備用。

    1.4 SCI大鼠模型制作

    取SD大鼠用10%水合氯 醛腹腔注射 麻 醉(300 mg/kg)后,麻 醉 生 效 后 固 定 于解剖板上備皮消毒,以胸10為中心做5cm 長切 口,逐層分離暴露胸9、10、11棘突和椎板,咬除棘突 及椎板充分暴露脊髓。根據改良 Allen法用5g砝 碼從16cm 高度通過適當粗細的玻璃試管自由下 落,砝碼柄端朝下,打擊面積約3.0mm2。砝碼自由 落下打擊到脊髓時大鼠迅速出現雙下肢回縮撲動及 擺尾動作,隨后出現遲緩性癱瘓,迅速移除砝碼后可 見脊髓充血 水 腫,提 示 SCI模 型 制 作 成 功,生 理 鹽 水沖洗后逐層關閉切口。術后膀胱按摩3~5次/d, 促進反射性排尿至恢復正常排尿,20萬 U/kg青霉 素皮下注射3~5d預防切口及泌尿系感染。

    1.5 干預方法

    SCI模型組:脊髓損傷模型制作成 功后 逐 層 關 閉 切 口,30 min 后 腹 腔 注 射 1 mL 的 0.9%氯化鈉注射液。BMSCs移植組:脊髓損傷模型 制作成功后30min腹腔注射1mL的0.9%氯化鈉注 射液,術后5d沿原切口切開暴露脊髓損傷節段,硬 膜下注射10μL的1×106/μL骨髓間充質干細胞單 細胞懸液。Fasdiual治療組:脊髓損傷模型制作成功 后30min腹腔注射1mL的Fasdiual(0.85mg/kg), 術后5d沿原切口切開暴 露 脊 髓 損 傷 節 段,硬 膜 下 注射10μL0.9%氯化鈉注射液。聯合治療組:脊髓 損傷模型制作成功后 30 min 腹 腔 注 射1mL Fasdiual(0.85mg/kg),術后5d天沿原切口切開暴 露脊髓損傷節段,硬膜下注射10μL1×106 個/μL骨 髓間充質干細胞單細胞懸液。

    1.6 運動功能評分

    由 本 課 題 組2名 研 究 人 員 采 用 BBB(basso-beattie-bresnahan)評 分 法 分 別 于 SCI術后第1、7、14、21、28天同一時間段對各組大鼠 后肢運動功能進行評分,評分范圍0~21分,0分為無 后肢運動,21分為后肢正常運動,評分取平均值。

    1.7 組織學觀察

    SCI術后第28天各組大鼠腹腔 注射10%水合氯醛,麻醉處死各 組 SCI大 鼠,按 原 切口進入,以損傷脊髓節段為中心切取約1cm 長度 完整脊髓組織,置于4%多聚甲醛固定48h,常規梯 度脫水、石蠟包埋。取蠟塊制片,厚度4μm,60℃烤 箱烤片過夜備用。切片經脫蠟、脫水、透明后分別進 行 HE、免疫組 織 化 學、免 疫 熒 光 染 色,鏡 下 觀 察 脊 髓標 本 形 態 學 結 構 以 及 NSE、NF200、GFAP 的 表達。

    1.8 免疫組織化

    學 半 定 量 分 析 采 用Image-Rro- Plus圖像分析軟件對免疫組織化學染色結果進行 分析,根據陽性染色細胞及染色強度計算出光密度 值,用于后續統計分析。

    1.9 統計學處理

    數據采 用 SPSS17.0軟 件 進 行 統計分析,服從正態分布的計量資料以均數±標準 差 (x- ±s)表示,組間比較采用方差分析,組間兩兩 比較 采 用 SNK-q,以 P <0.05 為差異有統計學 意義。

    2 結果

    初次換液后原代細胞呈集 落分布于培養瓶,經傳代后均勻生長,3代細胞均勻 分布,細胞呈梭形。3代細胞表型 CD29、CD45的陽 性率分別為82.4%、2.0%,見圖1。


    各 組 SCI大 鼠 術 后1d評 分 均 位 于較低水平,運動范圍為無運動到1~2個關節的輕 微運動,術后1~28d各組 SCI大鼠運動功能均有 改善,以術后14~28d改 善 幅 度 相 對 較 大,以 聯 合治療組運動改善效果最佳,聯合治療組在損傷第14 天開始SCI大鼠 BBB評分逐漸優于其余治療組,且 差異有統計學意義 (P <0.05),見表1。SCI術后第28天觀察各組標本 HE 結果顯示聯合治療組脊髓傷修復效果明顯,脊髓空洞面積最 小,其 次 為 BMSCs移 植 組 和 Fasdiual治 療組,而SCI模 型 組 空 洞 面 積 最 大,損 傷 組 織 的 修 復效果較差,見圖2。BMSCs移植組、Fasdiual治療 組和聯合治 療 組 分 別 與 SCI模 型 組 相 比 差 異 均 有 統計學意義 (P <0.05),見表2。

    3 討論

    脊髓損傷(SCI)由初始的原發性和漸進的繼發 性兩部分損傷共同所致。目前,因各種外傷 因 素 造成脊髓結構破壞的原發性損傷還無法可控,僅限 于手術解除壓迫為脊髓恢復創造有利條件;然而,以 脊髓水腫、炎癥反應、神經細胞凋亡、神經元不能再 生一系列聯動的繼發性損傷是可以干預的,也是當 前解決脊髓損傷再生修復的研究方向。脊髓損傷 后軸突再生和正確靶向是損傷后脊髓修復與功能重 建的難點,干細胞移植治療脊髓損傷能很好解決這一難題,其 中 的 BMSCs定 向 分 化 移 植 是 最 具 應 用 前景之一。但 由 于 BMSCs移 植 于 損 傷 脊 髓 后 會繼發性損傷出現移植細胞生存率下降、生長緩慢、 定向分化抑制等不利的方面。所以,本課題以此為 據點進行研究。

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