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    鈣離子濃度的影響-博迅安全柜的使用!

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-10-11 10:13【

    反流性食管炎 ( reflux esophagitis,RE) 是胃 液或混合腸液反流刺激等原因引起的食管黏膜炎性 病變,可導致食管黏膜出血、食管狹窄、吞咽困難等。近年來,RE 的發病率有不斷上升的趨勢, 其并發癥 Barrett 食管、食管腺癌等已成為消化領 域的研究熱點。目前一過性食管下括約肌松弛 被認為是引起 RE 的最主要因素,可能與平滑肌細 胞中的游離 Ca2 + 濃度有關。另外,亦有研究顯示,5-羥色胺 ( 5-HT) 是參與調節胃腸道運動 和分泌功能的重要神經遞質。RE 屬于中醫學 “吞 酸” “吐酸” “嘈雜” “胃脘痛” “食管癉”等范 疇。研究顯示,旋覆代赭湯治療 RE 療效顯著。 本研究觀察旋覆代赭湯對食管平滑肌細胞 ( ESMC) 中 5-HT、Ca2 + 的影響,探討旋覆代赭湯治療 RE 的可能作用機制。

    1 材料與方法

    1. 1 動物

    SPF 級雄性 Wistar 大鼠 45 只,8 周齡,體質 量 ( 220 ± 20) g,由浙江中醫藥大學實驗動物中 心提供,實驗動物合格證號: SCXK ( 滬) 2013- 0016。本研究通過浙江中醫藥大學倫理委員會審 批,批件號: ZSLL-2016-130。

    1. 2 藥物

    旋覆代赭湯根據其在 《傷寒論》中原方的劑 量換算: 旋覆花 15 g,赭 石 5 g,清 半 夏 15 g, 生姜 25 g,人參 10 g,炙甘草 15 g,大棗 15 g,由 浙江中醫藥大學門診部提供,水煎濃縮成含生藥量 1 g /ml 的藥液,置冰箱中 4℃保存。

    1. 3 主要試劑及儀器

    胎牛血清 ( 批號: 20150520) ,杭州四季青生 物工程材料有限公司; DMEM 培 養 基 ( 批 號: 1897299) ,Sigma 公司; 平衡鹽溶液 ( Hanks 液, 批號: 20170331) ,吉諾生物醫藥技術有限公司; 磷酸緩沖鹽溶液 ( PBS,批號: 02 /2019) 、CCK-8 試劑盒 ( 批號: D824FD0251) 、大鼠蛋白激酶 A ELISA 試劑盒 ( 批號: 201710) ,均購自上海生工 生物工程有限公司; FITC-羊 抗 兔 IgG ( 批 號: BST12E02A05 ) 、 FITC-羊 抗 小 鼠 IgG ( 批 號: BST12E02A01) 、5-羥色胺 4 受體 ( 5-HT4R) 抗體 ( 批號: 003112A81113) 、兔抗大鼠 α 平滑肌激動蛋 白 ( α-SMA, 批 號: 4A4 ) 、 羊 血 清 ( 批 號: 13B01A09) 、DAPI 染液 ( 批號: 12D20B77) 、4% 多 聚甲醛 ( 批號: 12G30B69) ,武漢博士德生物工程 有限公司; 馬來酸替加色羅 ( 批號: 189188-57-6) , 上海陶素生化科技有限公司 ; GR113808 ( 批號: 3A/203952 ) , TOCRIS 公 司; Forskolin ( 批 號: 15771 ) 、 SQ22536 ( 批 號: 22969 ) , Medchem Express 公 司; 大 鼠 cAMP ELISA 試 劑 盒 ( 批 號: 1803251) ,上海西唐生物科技有限公司; 免疫染色 通透液 ( 0. 2% Triton X-100,批號: P0096) 、鈣離 子熒光探針 ( Fluo-3 /AM,批號: 09011711207) ,上 海碧云天 生 物 技 術 有 限 公 司; 水 合 氯 醛 ( 批 號: I1607002) ,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。 上海博迅BSC-1000A2生物安全柜; 3111 型細胞培養箱、Heraeus Multifuge X1R 型 高速離心機,Thermo 公司; 30050303 型多功能酶 標儀,TECAN 公司; DS-Ri2 型高級分析倒置顯微 鏡,Nikon 公 司; LSM880 型 激 光 共 聚 焦 顯 微 鏡, ZEISS 公司。

    1. 4 原代細胞提取

    采用隨機數表法取 5 只大鼠用于分離正常大鼠 原代 ESMC,實驗前大鼠禁食未禁水 24 h,10% 水合氯醛 0. 35 ml /100 g 腹腔注射麻醉,腹部正中 剪開,暴露腹腔,分離食管下端,剪斷并獲取食管 下 1 /3,立即放入呈有 PBS 的培養皿中。將培養皿 移入超凈臺內,用 PBS 沖洗 3 次,剝離食管黏膜、 漿膜等雜質。轉移呈有 DMEM 的培養皿中,將其 剪成約 1 mm2 的小塊。再用巴氏吸管將組織懸液移 入 15 ml 離心管,室溫 800 r /min 離心 5 min,離心 半徑 8 cm。離心完畢,棄去上清液,加入約 2 ml 含 FBS 重 懸 組 織,移 入 25 cm2 培養 瓶 中,吸 去 FBS,將培養瓶倒置于 37℃ 5% CO2 培養箱中靜置培養 4 ~ 5 h,待組織牢固貼于培養瓶上,加入 20% FBS DMEM 培養基 3 ml 培養,隔 3 天換 1 次液。

    2 結果

    原代培養的 ESMC 培養 3 ~ 4 天有少量細胞從 組織塊周圍爬出,2 周時細胞生長為單層,鋪滿瓶 底,細胞形態不規則,成梭形、三角形或菱形,4 周時細胞排列致密,呈 “峰谷樣”生長。ESMC 中 α-SMA 呈陽性,細胞純度較高。在 5% 、10% 、20% 、30% 藥物濃度 下,旋覆代赭湯低、中劑量組對 ESMC 干預后 OD 值較空白組均升高 ( P < 0. 05 或 P < 0. 01) ,而旋 覆代赭湯高劑量組僅在 5% 濃度下 OD 值較空白組 升高,并 且 在 30% 濃 度 下 OD 值 較 空 白 組 降 低 ( P < 0. 01) 。旋覆代赭湯低劑量組在 5% 、10% 、 20% 、30% 藥物濃度下增殖率分別為 188. 68% 、 152. 49% 、168. 36% 、137. 5% ,旋覆代赭湯中劑 量 組 分 別 為 153. 28% 、 155. 66% 、 138. 12% 、 132. 73% ,旋覆代赭湯高劑量組分別為 168. 24% 、 122. 07% 、84. 13% 、71. 80% ,提示 5% 旋覆代赭 湯低劑量組對 ESMC 的增殖作用最強,故選取用于 后續實驗。與空白血清組比較,中 藥 組、5- HT4R 激動劑組和 5-HT4R 抑制劑組的 5-HT4R 熒光 強度顯著增加,中藥組和 5-HT4R 激動劑組、AC 激動劑組 Ca2 + 熒光增強比值及 cAMP 濃度顯著增 加 ( P < 0. 05 或 P < 0. 01) 。與 5-HT4R 激動劑組比 較,5-HT4R 激動劑加中藥組 Ca2 + 熒光增強比值增 加( P < 0. 0 1 ) 。與AC激 動 劑 組 比 較,AC激 動 劑加中藥組 5-HT4R 熒光強度、Ca2 + 熒光增強比值顯 著增 加 ( P < 0. 01) 。與 5-HT4R 抑制 劑 組 比 較, 5-HT4R抑制劑加中藥組 5-HT4R 熒光強度、Ca2 + 熒 光增強比值、cAMP 濃度均增加 ( P < 0. 05 或 P < 0. 01) 。與 AC 抑制劑組比較,AC 抑制劑加中藥組 5-HT4R 熒光強度、Ca2 + 熒光增強比值、cAMP 濃 度均增加 ( P < 0. 05 或 P < 0. 01) 。

    3 討論

    中醫學認為,RE 多由于素體稟賦不足或飲食 不節、情志失調、久病不愈、勞倦內傷等引起脾胃 虛弱,中焦氣機升降失常,氣機痞塞,而見心下痞 悶; “脾宜升則健,胃宜降則和”,胃氣因虛上逆, 又兼噯氣、反胃、呃逆、反酸等癥。病機多屬于脾 胃虛弱,痰阻氣逆,升降失常,故顧護脾胃、調暢 氣機為其基本治則,常用旋覆代赭湯治療本病。我 們前期研究發現,旋覆代赭湯能夠干預 RE 的 發生發展,可修復鈣離子通道,引起胞內 Ca2 + 濃 度升高,提高食管平滑肌張力,但通過何種途徑仍 未明確。

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