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    脾虛小鼠感染念珠菌分析-博迅滅菌器的使用!

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-10-10 10:51【

    白色念珠菌是一種條件致病性真菌,通常情況 寄生于人體的口腔、腸道、陰道以及皮膚的表面。念 珠菌的存在與機體的微生物(如細菌、病毒等)是處 于共生互利的狀態,但當人體患有某些疾病(如腫 瘤、癌癥、糖尿病等)時,免疫功能的降低易引起菌 群失調,甚至會引起呼吸、消化等功能的異常。近 些年感染系統性白色念珠菌的越來越多,其原因頗 多,例如激素、使用免疫抑制劑包括大量使用一些抗 腫瘤等藥物,致使機體對抗白色念珠菌的感染能 力下降,致使菌群失衡患者的發病率及病死率顯著 上升。

    1 實驗材料

    1.1 實驗藥物

    四君子湯(人參9 g,白術9 g,茯苓9 g,甘草6 g), 購買于沈陽市皇姑區成大方圓藥房,依照傳統的方 法將其制成水煎制劑。先將中藥用蒸餾水浸泡 2 h, 加熱煮沸改為文火 15 min,濾出藥液,再次加入蒸餾 水煎 20 min,將 2 次藥汁混勻,放置 4 ℃冰箱。 甘藍洗凈放好,肥豬油用鍋熬制好,放置 4 ℃冰 箱。 氟康唑膠囊,石家莊四藥有限公司產品,批號: H10970299。生理鹽水將其溶解之后制成混濁液, 調整至藥物濃度為 0.4 mg/mL(10 mg/kg)。 白色念珠菌的菌株是由北京大學第一醫院贈 與,Candida albicans(03382 株)。

    1.2 實驗動物

    小鼠購買于遼寧長生生物科技有限公司的 SPF 級昆明種,實驗動物的生產許可證號為:SCXK(遼) 2010-0001。將購買的實驗動物飼養于具有 SPF 級 動物室的實驗中心內,即遼寧中醫藥大學動物室的 許可證號:SYXK(遼)2013-0009。 1.3 試劑與器材 anti-IFN-γ:abcam 公司產品,批號:ab24979。 Western-blot 試劑均購于碧云天生物技術有限 公司,其中包括:標準蛋白質分子量,批號:P0062; 蛋 白 標 準,批 號:P0007;BCA 蛋 白 濃 度 測 定 試 劑 盒,批 號:P0012;Western 及 IP 細 胞 裂 解 液,批 號: P0013;SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒,批號:P0012A; Western-blot 蛋白上樣緩沖液,批號:P0015L;超敏 ECL 化學發光液試劑盒,批號:P0018;Western- 抗 體稀釋液,批號:P0023A。 電子天平選用上海舜宇恒平科學儀器(JA2003 型),生物安全柜選用青島海爾特種電器(HR40- IIA2 型),上海博迅YXQ-75SII立式壓力蒸汽滅菌器,全自動凝膠圖像分析選用上海天能 (Tanon-4200SF 型)。

    2 實驗方法

    2.1 接種菌液的配制

    在高溫高壓滅菌后的沙堡培養基上將白念 珠菌株轉種培養 2~3 次,放入 37 ℃恒溫箱中培養 24 h。選用無菌生理鹽水將其轉種后的念珠菌 進行稀釋,取一滴稀釋好的懸液滴在 16×25 計 數板上,然后進行計數,最終將菌液調整為 2× 108 CFU/mL。

    2.2 分組、制造模型及處理方法

    正常飼養 1 周后,采用隨機分成法將小鼠分 為 5 組,即空白對照組(A)、脾虛模型組(B)、脾 虛 + 白念珠菌組(C)、脾虛 + 白念珠菌 + 氟康唑 組(D)、脾虛 + 白念珠菌 + 四君子湯組(E),每組 10 只。除空白對照組(A)10 只小鼠以外,其余參 照文獻將采用復合因素法制備脾虛模型,單日 游泳直到耐力極限,身體蜷縮,喂生甘藍,正常飲 水,雙日灌胃豬油 0.5 mL/ 只,連續造模 14 d。參 照脾虛造模診斷的宏觀標準對脾虛模型小鼠 進行評估。若模型小鼠出現體重降低,肛門周邊 有稀便甚至出現便溏,食少納呆,疲乏無力,毛色 枯槁,卷縮扎堆等表現,提示脾虛制造模型成功。 造模成功的次日經口感染白念珠菌懸液給 C、D、 E 組的小鼠 0.5 mL/ 只(濃度為 2×108 只 /mL),而 A、B 組給以 0.5 mL/ 只生理鹽水。

    2.3 給藥方法

    經口感染白色念珠菌的次日開始灌胃治療,脾 虛 + 白念珠菌 + 氟康唑組(D)小鼠給予氟康唑灌胃 治療,脾虛 + 白念珠菌 + 四君子湯組(E)組小鼠給 予四君子湯灌胃治療。每日 1 次,連續 2 周。

    2.4 指標檢測

    2.4.1 觀察四君子湯對脾虛小鼠感染白色念珠菌后

    小腸組織中IFN-γ含量的影響 治療的第 14 天斷髓處死后取出小鼠小腸的空 腸 段 0.1 g,用 PBS 沖 洗 干 凈,放 置 于 1.5 mL EP 管 中,-80 ℃冰箱凍存備用。提取每組小鼠小腸組織 中總蛋白,采用western-blot法檢測其IFN-γ蛋白含 量的表達。首先檢測其蛋白濃度,根據蛋白濃度,用 上樣液調整好上樣的量,最終蛋白的量為15 μg/孔, 在電壓 80 V/120 V 條件下開始跑膠,大約 2 h 左右, 關閉電源。將蛋白質從凝膠轉移至濾膜上,采用濕 轉,100 V 轉移 1.5 h。抗原抗體∶一抗(1∶500)、二 抗(1∶1500)放置在 4 ℃冰箱里進行孵育過夜后,第 2 天顯色,等體積的 ECL 每膜 1 mL,用自動凝膠圖像 分析系統進行拍攝,測其條帶的灰度值,將其數統計 分析。

    2.4.2 觀察四君子湯對脾虛小鼠感染白色念珠菌后

    小腸組織中IFN-γmRNA含量的影響 治療的第 14 天斷髓處死后取出每只小鼠小腸 的空腸段 0.1 g,用 PBS 沖洗干凈,放置于 1.5 mL EP 中,-80 ℃冰箱凍存,待檢。對每組小鼠小腸組織中 IFN-γmRNA 的含量選用 RT-PCR 法進行檢測。首 先進行總 RNA 提取,及 RNA 濃度和純度測定,之后 進行 cDNA 的逆轉錄合成和 PCR 反應,最后用瓊脂 糖凝膠進行電泳。將凝膠成像用全自動凝膠圖像分 析系統進行分析,測定每條條帶的積分光密度值,記 錄數據統計分析。2.5 統計學方法 對每組數據選用 SPSS10.0 統計軟件進行分析。 小鼠腸組織當中的 IFN-γmRNA 及蛋白含量采用 x —±s 表示,P<0.05 被認為有顯著性差異。

    3 實驗結果

    如實驗結果示:與 A 組比較,B 組蛋白表達 水平顯著升高(P<0.05),C、D、E 組小鼠腸組織 當中 IFN-γ 蛋白的含量在治療后均顯著升高 (P<0.01)。 與 B 組 比 較,C 組 小 鼠 小 腸 組 織 中 IFN-γ 蛋白的含量顯著升高(P<0.01),D、E 組小 鼠小腸組織中 IFN-γ 蛋白的含量在治療后均升 高(P<0.05)。與 C 組比較,D 組、E 組鼠小腸組織 中 IFN-γ 蛋白的含量在治療 14 d 后均無統計學 意義。與 D 組比較,E 組小鼠腸組織當中 IFN-γ 蛋白的含量在治療 14 d 后無統計學意義。如實驗結果示:與 A 組比較,B、C、D、E 組小鼠 腸組織當中 IFN-γmRNA 的含量在治療后均明顯 升高(P<0.01),具有統計學意義。與 B 組比較,C、D、 E 組小鼠腸組織中當 IFN-γmRNA 的含量在治療后 均升高(P<0.01),具有統計學意義。與 C 組比較,D 組、E 組小鼠小腸組織中 IFN-γmRNA 表達水平均 無統計學意義。

    4 討論

    “內傷脾胃,百病由生”,脾居中焦,主運化水谷 精微,氣血生化之源,氣機升降之樞紐。若脾臟 出了問題,即不能化生氣血,升降功能又失調,就會 影響正氣。一些研究者發現,中醫臟象學描述的 “脾”,從它的位置、形態上來看,實際就是我們現代 解剖學中的脾和胰等,而且這些組織和器官都是幫 助機體消化、提高機體免疫功能的器官和組織學基 礎,因此說明脾有防御功能,若脾氣虛弱導致防 御能力下降,則“百病由生”。而脾虛證大多指的 是脾氣功能不足、不能運化、失其健運等。四 君子湯為經典治療脾虛方劑,對于腸道菌群失調研 究也頗多。而目前研究者發現,白色念珠菌的易 感染性與機體的免疫防御功能有關,當機體免疫功 能降低時發生白色念珠菌感染,會引起機體內細胞 因子含量的變化,部分疫功能也受到一定程度的抑制。

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