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    氣道炎癥的影響分析-上海博迅BXM-30R的應用

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-09-24 11:55【

    感染后咳嗽與氣道廣泛的炎癥密切相關。氣道 炎癥可由細菌或病毒介導,氣道炎癥反應時,氣道上皮 損傷,炎性細胞活化并浸潤于氣道,大量細胞因子和炎 性介質產生和釋放,使氣道壁神經暴露,并使以磷脂形 式存在于細胞膜上的花生四烯酸( AA) 在 PLA2 和 PLC 催化下,從磷脂池中釋放出來,在 AA 代謝酶的作 用下轉變為具有生物活性的代謝產物,發生 AA 的炎 癥級聯代謝。本課題組前期進行了射干的藥效學 實驗研究,結果表明: 射干具有抗炎、止咳、祛痰、增強 機體免疫功能、解熱、鎮痛、抑菌等藥理作用。通 過經典化學方法,對射干進行了分離,獲得了具有顯著 生理活性的異黃酮類化合物野鳶尾黃素。

    1 材料與方法

    1. 1 主要藥物與試劑

    野鳶尾黃素( 100509) 均購于江蘇永健醫藥科技 有限公司。肺寧片購自吉林吉春制藥股份有限公司 ( 20140206) ; Hep - 2 人喉表皮癌細胞購自江蘇齊氏生 物科技 有 限 公 司; RSV 由中科院武漢病毒所贈予; DMEM 培養液和胎牛血清購自 CORNING 公司; DMSO 購自美國 Sigma 公司; 胰酶和青鏈霉素購自中國醫學 科學院生物工程研究所; BCA 蛋白試劑盒購自 Beyotime 公司( Lot NO: P0012 - 1) ; 顯影粉、定影粉,購自 天津市世紀奧博商貿有限公司; protein loading buffer 購于北京全式金生物科技有限公司( Lot NO: 120703) ; T - bet 抗體購于美國 abcam 公司; GATA - 3 抗體購于 武漢博士德生物; 二抗( bs - 0295G - HRP) 購于 bioss 博奧森。

    1. 2 主要儀器

    組織勻漿機( MagNA Lyser,瑞士羅氏) ; 噴霧儀 ( EM99 - 002,惠州斯萊達) ; 全自動模塊式血液體液分 析( XN - 1000,日本 Sysmex 公司) ; 熏煙箱( 自制) ; 三 氣培 養 箱 ( CB210,德 國 Binder) ; 倒置熒光顯微鏡 ( XDS - 500C,上海蔡康) ; 超凈工作臺( SW - CJ - 2D, 蘇州凈化) ; 低速離心機( BY - 400C,北京白洋) ; 立式蒸汽滅菌器( BXM - 30R,上海博訊實業有限公司醫療設備廠
    ) ; 微型旋渦混合儀 ( XW - 80A,上海滬西) ; 分析天平( XS105,瑞士 Mettler - Toledo) ; 轉印槽( 170 - 390,美國 Bio - Rad) ; 電Q,德國默克) 等。 


    1. 3 實驗動物

    SPF 級雄性豚鼠 40 只,體質量 250 ~ 400 g,購自 北京維通利華實驗動物技術有限公司,在遼寧省中醫 藥研究院( 遼寧中醫藥大學附屬第二醫院) 動物實驗 中心飼養,環境許可證號: SYXK( 遼) 2012 - 0003,濕 度 40% ~ 70% ,溫度 20 ~ 26 ℃,自由飲水。

    1. 4 實驗方法

    1. 4. 1 感染后咳嗽模型的建立

    SPF 級雄性豚鼠在 SPF 級環境下飼養,空白對照組動物單獨飼養,在適應 新的環境 1 周后開始實驗,除空白組外,把其他組豚鼠 放入自制體積為450 mm × 450 mm × 900 mm 的煙熏箱 內,5 只一籠,一箱裝 6 籠,將 10 支新一品黃山牌香煙 點燃放入 50 g 刨花中產生煙霧,并置于自制煙熏箱 內,每日 1 次,每次持續煙熏 30 min,自由進食、飲水, 連續 7 d,分別于實驗的第 2、3 天,用乙醚淺麻醉豚鼠 后,經鼻腔滴入已事先擴增凍存好的滴度為 8 × 106 pfu /mL 的病毒液,滴入體積以體質量 1 μL /g 計算。

    1. 4. 2 實驗動物分組及給藥方法

    將 70 只 SPF 級豚 鼠適應性飼養 1 周后,隨機分為 7 組,即空白組、模型 組、中藥陽性組[肺寧片 512 mg /( kg·d) ]和野鳶尾黃 素組[48 mg /( kg·d) ],每組 10 只。按“1. 4. 1”制備 感染后咳嗽動物模型,除模型組外,其它各給藥組在第 8 天時開始給藥,每天 1 次,連續給藥 7 d,空白組給予 等體積生理鹽水。

    1. 4. 3 感染后肺組織

    RSV 病毒檢測 將實驗豚鼠以 25 mg /kg 用 2% 戊巴比妥麻醉后,在無菌條件下取模 型組和空白組豚鼠約 100 mg 肺組織,加 PBS 溶液 1 mL 勻漿,勻漿機 6500 r/min,50 s,勻漿兩次后,離心機 2000 r/min 離心 10 min,加入鏈霉素溶液 10 μL,充分 混勻,用移液器仔細吸取上清 100 μL,接種于 Hep - 2 細胞上,在 DMEM 培養基( 含 2% 牛血清) 中生長,每 日仔細觀 察 病 變,若 有 特 征 性 病 變 出 現 者,確 定 為 RSV 陽性。

    2 結果

    細胞上培養至第 2 天可見細胞變化,逐漸腫脹、變 圓和聚集,細胞之間的間隙增大,第 4 天逐漸出現多核 巨細胞( 又稱融合細胞) ,提示 RSV 病毒感染成功 。全自動模塊式血液體液分析儀上測定各組豚鼠肺 泡灌洗液中白細胞總數、單核計數、淋巴細胞計數、嗜 酸性粒細胞計數及中性粒細胞計數,結果表明,模型組 肺泡灌洗液中中性粒細胞計數顯著高于空白組( P < 0. 01) ,白細胞總數、淋巴細胞、單核細胞及嗜酸性粒 細胞計數顯著高于空白組,差異有統計學意義( P < 0. 05) ,提示模型組豚鼠具有氣道炎癥。給藥后,野鳶 尾黃素對嗜酸性粒細胞有顯著抑制作用( P < 0. 05) 。具有祛痰利咽、消癖散結、清熱解毒、消腫 止痛的功效,是中醫治療喉痹咽痛之要藥。有研究表明射干對炎癥早期和晚期均有明顯的抑制作用,野鳶尾黃素是射干中的活性成分,但目前 其治療感染后咳嗽和氣道炎癥尚無報道。本實驗采用 公認的 RSV 感染豚鼠的方法復制感染后咳嗽模型,采 用野鳶尾黃素進行治療,并通過枸櫞酸引咳觀察其鎮 咳作用,采用全自動模塊式血液體液分析儀檢測檢測 肺泡灌洗液中炎性細胞,采用 HE 法觀察對肺組織形 態學的影響,采用 ELISA 試劑盒法檢測肺泡灌洗液中 細胞因子,采用 Western Blot 法檢測 Th1 和 Th2 特異 性轉錄因子 T - bet 和 GATA - 3 蛋白的表達,揭示射 干不同異黃酮單體化合物抗氣道炎癥的作用及其機 制。

    3 討論

    感染后咳嗽又稱為“感冒后咳嗽”,是指呼吸道 感染發熱等急性期癥狀消失后,咳嗽仍遷延不愈,可持 續 3 ~ 8 周的時間,呈喉癢、干咳或咳少量白色黏液痰, 血常規、C 反應蛋白、胸片提示無異常,是呼吸道感染 后常見的并發癥。射干,是多年生草本鳶尾科植物 射干[Belamcanda chinensis( L. ) Redouté]之干燥根莖, 最早記載于《神農本草經》。其味苦、辛,性寒,微毒,RSV 感染咳嗽模型。

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