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    上海博訊培養箱分析細胞增殖的影響

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-09-23 11:23【

    近年來,大豆異黃酮因為其潛在的抗腫瘤生 物活性而受到研究者廣泛關注。大豆異黃酮的結 構與內源性雌激素相似,具有弱雌激素效應,被稱 為植物雌激素。大豆異黃酮對乳腺癌、前列腺癌 等雌激素依賴性腫瘤的抑制作用已經得到廣泛證實。隨著研究的深入,研究者發現大豆異黃 酮對非傳統意義上的雌激素依賴性腫瘤也有抑制 作用,如大腸癌。

    1 材料與方法

    1. 1 儀器與試劑

    外消旋雌馬酚及其對映異構體( 純度>99%) 購于 美 國 LC Laboratories 公 司,雌 激 素 受 體 [estrogen receptor,ERα ( SC-542 ) ]、ERβ ( SC8974) 、β-actin ( SC-47778) 和核因子紅系 2 相關 因子 2[nuclear factor ( erythroid-derived 2) -like 2, Nrf2]抗體購自美國 Santa Cruz Biotecnology 公司, 二抗抗體購自愛爾蘭 Rockland 公司,胰酶、胎牛 血清、細胞培養基購于美國 Invitrogen 公司,蛋白 提取、定量及蛋白免疫印跡相關材料試劑購自美 國 Bio-rad 公司,3-( 4,5-二甲基噻唑-2) -2,5-二苯 基四氮唑溴鹽[3-( 4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5- diphenyltetrazolium bromide,MTT]試劑購于美國 Sigma 公司,雌激素受體( estrogen receptor,ER) 抑 制 劑 ( ICI182780 ) 、ERα 激 動 劑 [1,3,5-tris ( 4-hydroxyphenyl ) -4-propyl-1Hpyrazole,PPT]和 ERβ 激動劑( diarylpropionitrile,DPN) 購于美國 Sigma 公司。酶聯免疫檢測儀為美國 Thermo 公 司產品。

    1. 2 細胞培養

    人大腸癌 HCT15 細胞購自北京協和醫學院 基礎醫學細胞中心,用含 10%胎牛血清的 1640 培 養基,在 5% CO2、37 ℃博訊常溫培養箱(上海博訊BPX-272
    )中培養。 


    1. 3 細胞增殖檢測

    對數生長期的 HCT-15 細胞,胰酶消化后,用 含 10%胎牛血清的培養液配成單細胞懸液,每孔 2 ×103 個細胞接種到 96 孔板,每孔體積 100 μL。 相同培養條件下培養 24 h 至細胞貼壁。根據前 期研究,加入含 0、0. 5、1、5 和 10 μmol /L 外消旋雌馬酚或雌馬酚對映異構體的培養液 100 μL, 每個濃度設置 10 個復孔。培養 24、48、72 和 96 h 后,加入 10 μL MTT,繼續孵育 1. 5 h 后終止。在 570 nm 和 650 nm 波長處測定吸光度( A) 。計算 HCT-15 細胞的增殖率( proliferation rate,PR) 和抑 制率( inhibition rate,IR) ,計算公式為: 增殖率 = A570-A630,抑制率= ( 增殖率對照組 -增殖率實驗組 ) /增 殖率對照組 ×100%。

    1. 4 蛋白質表達水平測定

    將對數生長期的 HCT-15 細胞用含 10%胎牛 血清的培養液配成單細胞懸液,每孔 5×104 個細 胞接種到 6 孔板,每孔體積 2 mL。過夜后加入 0、 0. 5、1、5 和 10 μmol /L 外消旋雌馬酚或其對映異 構體,48 h 后 加 入 含 1 mol /L 苯 甲 基 磺 酰 氟 ( PMSF) 的細胞裂解液,冰上裂解 30 min 后,4 ℃, 12 000 r /min 離心 5 min 取上清,用聚氰基丙烯酸 正丁酯( butyleyanoacrylate,BCA) 蛋白濃度測定法 進行定量。50 μg 總蛋白等量上樣,10%聚丙稀銑 胺凝 膠 電 泳 ( polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 分離蛋白,濕法轉至聚偏氟乙烯膜。5%脫 脂奶室溫封閉 2 h 后,ERα、ERβ、Nrf2 和 β-actin 一抗用 5%脫脂奶 1 ∶200 稀釋,4 ℃ 孵育過夜。用 TBST 緩沖液( tris buffered saline,with tween-20, pH 8. 0) 漂洗 3 次后加入二抗,室溫孵育 1 h,使 用增強熒光發光試劑顯影,然后使用圖像成像系 統檢測條帶。

    1. 5 統計學分析

    用 SPSS 22. 0 統計軟件進行分析,多組間比 較用方差分析,進一步兩兩比較采用 SNK 檢驗, 顯著性水準 α = 0. 05。

    2 結果

    外消旋雌馬酚及( R) 雌馬酚可 以抑制大腸癌 HCT-15 細胞的增殖( P< 0. 05) ,且 隨著劑量增加抑制作用增強,而( S) 雌 馬 酚 對 HCT-15 細胞的增殖沒有明顯影響( P>0. 05) 。外消旋雌馬酚和( R) 雌馬 酚對 HCT-15 細胞增殖的抑制率呈先上升后回落 的趨勢,在第 3 天左右達到最大,此時外消旋雌馬 酚的 IC50 為 59. 6 μmol /L,( R) 雌 馬 酚 的 IC50 為5. 1 μmol /L。此外,Nrf2 蛋白表達也隨外消 旋雌馬酚濃度的增加而增加。( R) 雌馬酚刺激 HCT-15 細胞后,Nrf2 蛋白表達隨其濃度的增加而 增加,但未發現 ER 表達水平受到影響。

    3 討論

    有研究報道大豆異黃酮的攝入可以減少大腸癌的發病風險,但是大豆異黃酮的代謝產物雌馬 酚,尤其是雌馬酚對映異構體對大腸癌的影響少 有研究。本研究以大腸癌 HCT-15 細胞為研究對 象,探討了外消旋雌馬酚及雌馬酚對映異構體對 大腸癌細胞增殖的影響及其機制。結果顯示,外 消旋雌馬酚可通過上調 ERβ 和 Nrf2 表達來抑制 HCT-15 細胞增殖,( R) 雌馬酚可通過上調 Nrf2 表 達來抑制 HCT-15 細胞增殖,( S) 雌馬酚對 HCT15 細胞增殖沒有影響。

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