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    上海博訊分析大鼠大腦皮質星形膠質細胞純化過

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-09-23 11:18【

    將 3 mL 0. 1 g /L L-多聚賴氨酸溶液注入用于 接種細胞的 T75 培養瓶中過夜,用無菌 PBS 洗 3 次,每次 10 min,常溫,置于無菌超凈臺內,1 h 內 接種細胞。用于差速粘附及傳代的培養瓶和培養 皿無需此處理。眼科彎鑷、直鑷及彎剪需提前浸 泡酒精,高壓烘干。將細胞懸 液接種至未用多聚賴氨酸處理過的 T75 培養瓶 中,37 ℃、5% CO2 培養 15 min,吸出剩余未貼壁 的星形膠質細胞懸液,輕柔吹打混勻后,將細胞以 5× 106 /mL 接種至多聚賴氨酸包被預處理過的 T75 培養瓶,37 ℃、5% CO2 培養。每隔 3 d 換液, 待細胞融合到 90%左右時,進行下一步操作。 細胞長滿 瓶 底 后,更換完全培養基,37 ℃ 恒 溫 搖 床 200 r /min振蕩 18 h。將培養瓶中上清液迅速倒 掉,用 PBS 洗 3 次,將每瓶細胞加入 1 mL 0. 25% 胰蛋白酶 37 ℃ 消化,倒置顯微鏡下觀察,待細胞 突觸回縮、大部分細胞脫落時,加入完全培養基終 止消化。反復吹打瓶壁,收集細胞,用于實驗或 傳代。

    將第一代( P1) 、第二代( P2) 、第三代( P3) 細 胞消化后取 100 μL 接種于 96 孔板中培養 4 h,加 入 MTS 溶液 20 μL 后,繼續在 37 ℃、5%CO2 博訊常溫培養箱(上海博迅HPX-9082MBE電熱恒溫培養箱
    )內孵育 4 h。每組重復 3 次,酶標儀檢測 λ = 490 nm 條件下吸光度值( A) 。免疫熒光法檢測星形膠質細胞特異性標志 GFAP,GFAP 陽性細胞在熒光顯微鏡下發出綠色 熒光,DAPI 染色后所有細胞的細胞核呈藍色,可見細胞胞體較大、突觸較長。隨機選取 3 個視野,計算陽性率為( 97. 86±0. 91) %。


    星形膠質細胞的分裂高峰發生在動物胚胎晚 期及出生以后,同時大腦皮層中混雜的神經元在 出生后不再增殖,因此星形膠質細胞的來源一般 選擇新生哺乳動物。由于出生 1 d 內鼠腦較小, 大腦皮層不易剝離,且出生 3 d 后大鼠大腦溝回 開始形成,軟腦膜與腦組織不易剝離,會造成軟 腦膜中成纖維細胞的干擾,因此本實驗選取出 生 2 d 的 SD 大鼠作為細胞來源。生 2 d 的 SD 大鼠作為細胞來源。 此外,0. 25%胰蛋白酶消化組織的時間可影 響星形膠質細胞純度及增殖活力,消化 40 min 時 細胞會有明顯損傷,因此本實驗嚴格控制消化時 間在 15 min。值得注意的是,雖然目前大多數研 究者使用 0. 25%胰蛋白酶消化組織制備單細胞 懸液,但其中的胰蛋白酶添加量并未提及。本 實驗發現,胰酶添加量取決于組織塊的大小,添加 量過多會導致細胞過度消化,添加量過少導致組 織消化不充分。因此本實驗將胰蛋白酶添加量設 定為每 2 只鼠腦皮質加入 500 μL 胰蛋白酶,可避 免細胞消化過度,導致大部分細胞死亡。 差速貼壁法和恒溫振蕩法為星形膠質細 胞培養中最常用的方法。差速貼壁法利用了成纖 維細胞貼壁時間短,星形膠質細胞貼壁時間長的 特性,可以很好地分離兩種細胞。在部分研究中采用恒溫振蕩法以去除附著的小膠質和 少突膠質細胞,將細胞置于 37 ℃ 恒溫箱中,以 250 r /min 的速度進行振蕩,雖然能夠起到純化作 用,但得到的星形膠質細胞數量相對減少,因此本 實驗采用 200 r /min 的速度恒溫振蕩 18 h,得到相 對較多且純度較高的星形膠質細胞。

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