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    上海博迅培養箱用于細胞株的建立

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-09-19 11:40【

    microRNA 是一類廣泛存在于真核生物中不編碼 蛋白質的短序列 RNAs 分子,在體內通過與靶基因的 3 '端非編碼區特異性結合,形成 RNA 誘導復合體,下調 相應蛋白質的表達水平。目 前 多 項 研 究 發 現miR-125b 可通過調控靶基因轉錄因子、基質金屬蛋白 酶、Bcl-2 家族成員等,與腫瘤、免疫性疾病、血液系統 及心血管疾病等的發生發展密切相關。

    1 材料與方法

    1. 1 實驗材料

    Jurkat T 細胞株及 293T 細胞株均購 自中國科學院昆明動物研究所。

    1. 2 實驗試劑

    hsa-miR-125b-5p 慢病毒過表達載體 ( mimic) 、hsa-miR-125b-5p 慢病毒過表達載體陰性對 照( mimic-nc) 、hsa-miR-125b-5p 慢病毒干擾載體( inhibitor) 、hsa-miR-125b-5p 慢病毒干擾載體陰性對照 ( inhibitor-nc ) ,美 國 GeneCopoeia 公 司,Lipofectamine 2000 轉染試劑( 美國 Invitrogen 公司) ,DH5α 感受態細 胞( 日本 Takara 公司) ,無內毒素質粒大提試劑盒( 北 京天根生化科技有限公司) ,胎牛血清( 美國 Gibco 公 司) ,DMEM 培養基、RPMI 1640 培養基( 美國 Hyclone 公司) ,Rneasy MiNi Kit ( 德 國 Qiagen 公 司) ,All-inOneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit、All-in-OneTM First-Strand cDNA Synthesis Kit ( 美 國 GeneCopoeia 公 司) ,RIPA Buffer、Protease Inhibitor Cocktail( 美國 SIGMA 公司) ,β-actin 抗體、UVRAG 抗體、goat anti-rabbit IgG-HRP( 美國 Santa Cruz 公司) 。

    1. 3 實驗儀器

    7500 型快速實時熒光定量 PCR 儀 ( 美國 ABI 公司) ,普通 PCR 儀( 深圳市賽泰克生物科技有限公司) ,垂直電泳儀和膜轉印裝置、凝膠成像系 統( 美國 Bio-rad 公司) ,細胞培養箱( 美國 Thermo 公 司) ,微量核酸濃度測定儀( 美國 Thermo 公司) ,臺式 冷凍離 心 機( 美 國 Thermo 公 司) ,低 速 離 心 機 ( SC3616,安徽中科中佳科學儀器有限公司) ,上海
    博迅BSC-1300B2生物安全柜 ,普通倒置 顯微鏡、熒光倒置顯微鏡( 日本 Olympus 公司) 。

    1. 4 hsa-miR-125b-5p 慢病毒載體及包裝質粒轉化至 大腸桿菌中及擴增

    采用 CaCl2 法將 miR-125b-5p 慢 病毒載體及包裝質粒轉化至 DH5α 大腸桿菌,挑選氨 芐青霉素抗性的單個菌落進行擴增培養,無內毒素質 粒大提試劑盒提取質粒,行瓊脂糖凝膠電泳觀察及 攝像。

    1. 5 細胞復蘇與培養

    液氮中取出 Jurkat T 細胞及 293T 細胞,37 ℃ 水浴化凍,Jurkat T 細胞加入含 10% 胎牛血清、1% PS 的 RPMI 1640 培養基,293T 細胞加入 含 10% 胎牛血清、1% PS 的 DMEM 培養基,置于37 ℃、 5% CO2 培養箱中孵育,當細胞生長至約 90% 密度時 傳代。

    1. 6 慢病毒包裝

    轉染前 24 h 取對數生長期的 293T 細胞進行傳代,加入無抗菌藥物的含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基,待細胞貼壁生長達 70% 融合時,按照 脂質體 Lipofectamine 2000 說明書將 hsa-miR-125b-5p 慢病毒過表達載體或 hsa-miR-125b-5p 慢病毒干擾載 體及相應對照載體和 psPAX2、pMD2. G 共同組成慢病毒包裝系統轉染 293T 細胞,置于 37 ℃、5% CO2 培養 箱中孵育 24 h 后棄上清,加入含 10% 胎牛血清、1% PS 的 DMEM 培養基培養 48 h。熒光倒置顯微鏡觀察 293T 細胞的熒光表達情況,收集富含慢病毒顆粒的細 胞上清液,3 000 r/min 離心 10 min,離心半徑 9 cm,去 除沉淀。

    2 結 果

    瓊脂糖凝膠電泳顯示 hsa-miR-125b-5p 慢病毒 過表達載體及對照,hsa-miR-125b-5p 慢病毒干擾載體 及對照,慢病毒包裝質粒 psPAX2、pMD2. G 與理想大 小相符合,可用于轉染 Jurkat T 細胞。利用慢病毒載體與包裝質粒( psPAX2、pMD2. G) 共同轉染 293T 細 胞,熒光倒置顯微鏡觀察 hsa-miR-125b-5p 慢病毒過表 達載體及對照載體組 293T 細胞均可見大量的綠色熒 光,hsa-miR-125b-5p 慢病毒干擾載體及對照載體組 293T 細胞均可見大量的紅色熒光。利用成功包裝 的慢病毒顆粒感染 Jurakat T 細胞,熒光顯微鏡觀察 hsa-miR-125b-5p 慢病毒過表達載體及對照載體組的 Jurkat T 細胞內均有明亮的綠色熒光表達。hsa-miR125b-5p 慢病毒干擾載體及對照載體組的 Jurkat T 細 胞內均有明亮的紅色熒光表達。和對照載體組比較,hsa-miR-125b-5p 慢 病毒過表達載體組 miR-125b-5p 表達水平明顯增高 ( P < 0. 01) ,hsa-miR-125b-5p 慢病毒干擾載體組 miR125b-5p 表達水平明顯降低( P < 0. 01) ,差異均有統計 學意義,見圖 1。

    3 討 論

    miR-125b-5p 屬于 miR-125 家族,miR-125 包括 hsamiR-125a 及 hsa-miR-125b 兩個亞家族,其中轉錄 miR125a 的基因位于染色體 19q13 上,而 miR-125b 由染色 體 11q23 和 21q2 兩個位點轉錄并分別形成 miR-125b-1 和 miR-125b-2。共 包 含 5 個 成 熟 體 miRNA: miR125a-3p、miR-125a-5p、miR-125b-1-3p、miR-125b-2-3p 和 miR-125b-5p,其中 miR-125b-5p 和 miR-125a-5p 的堿基 序列高度相似,miR-125b-1-3p 和 miR-125b-2-3p 的堿基 序列高度相似。miR-125 的表達具有高度保守性及廣泛 性。miR-125 家族最早由 Lagos-Quintana M 等于 2002 年在小鼠中發現并測序。2005 年 Lee Y S 等首次對 miR-125b-5p 的功能進行報道,發現其是分化的腫瘤細 胞增殖過程中的關鍵因子。至目前為止,已有大量研究 證實其在細胞凋亡、細胞增殖和分化、腫瘤抑制、 線粒體生物合成、細菌感染等病理生理過程中的 作用,其差異性表達也和多種疾病如急性心肌梗死、 多發性骨髓瘤、急性缺血性中風、肝細胞癌、骨 關節炎等有關。




     


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