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    立式蒸汽滅菌器對氣道炎癥的作用研究的使用

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-09-16 10:16【

    咳嗽是人們日常生活中常見的一種現象,它是人體的 一種應激反應,目前,其發病機制尚不完全明確,相關文獻 報道稱咳嗽或者與氣道炎癥反應、氣道黏膜損傷等因素有干系。呼 吸 道 合 胞 體 病 毒 ( respiratory syncytial virus, RSV) 是一種常見的冬季呼吸道病毒,影響所有年齡段的 人,是幼兒嚴重下呼吸道感染的主要原因。然而,RSV 在成 人中也是一種重要的病原體,特別是在老年人、慢性肺部疾 病患者或免疫功能受損的人群中。現代醫學認為病毒 感染導致了氣道變應性炎癥、氣道上皮損傷、氣道高反應等。

    1 材料與方法

    1. 1 實驗動物

    清潔級豚鼠,雌性,體質量 300 ~ 450 g,購自北京實驗 動物中心,動物使用許可證號: SYXK( 遼) 2012 - 0003。

    1. 2 主要試劑及儀器

    1. 2. 1 射干及提取物制備

    射干藥材購自亳州市星躍藥 業有限責任公司,由遼寧中醫藥大學植物教研室王冰教授 鑒定為鳶尾科射干 Belamcandachinensis( L. ) Redouté 的干 燥根莖。射干提取物的制備: 取射干片加 70% 乙醇,回流 提取 3 次,第 1 次加 8 倍量,第 2 次和第 3 次分別加 6 倍 量,每次提取 1 h,趁熱濾過,合并提取液,回收乙醇,濃縮成 稠膏,干燥,粉碎成細粉。

    1. 2. 2 試劑

    肺寧片購自吉林吉春制藥股份有限公司 ( 20140206) ; Hep - 2 人喉表皮癌細胞購自江蘇齊氏生物科 技有限公司; RSV 由中科院武漢病毒所贈予; DMEM 培養 液和胎牛血清購自 CORNING 公司; DMSO 購自美國 Sigma 公司; 胰酶和青鏈霉素購自中國醫學科學院生物工程研究 所; 色譜級醋酸銨、色譜級甲醇和色譜級乙腈購自德國默克 公司; Cis - 5,8,11,14 - Eicosic Acidtraenoic Acid ( AA) ( 批 號: U - 71A - F2 - Z) 和 Arachidonic Acid - d8 ( AA - d8) ( 批號: 0465985 - 16) 購自美國 Cayman Chemical 公司。

    1. 2. 3 主要儀器

    噴霧儀( EM99 - 002,惠州斯萊達) ; 全 自動模塊式血液體液分析( XN - 1000,日本 Sysmex 公司) ; 熏煙箱( 自制) ; 三氣培養箱( CB210,德國 Binder) ; 倒置熒 光顯微鏡( XDS - 500C,上海蔡康) ; 超凈工作臺( SW - CJ - 2D,蘇州凈化) ; 低速離心機( BY - 400C,北京白洋) ; 立式蒸汽滅菌器( BXM-30R,上海博訊) ; LC - MS /MS 聯用儀 ( Agilent6410 型,美 國 Agilent) ; 微型旋渦混合儀 ( XW - 80A,上海滬西) ; 分析天平( XS105,瑞士 Mettler - Toledo) ; 超純水機( Milli - Q,德國默克) 等。

    1. 3 實驗方法

    1. 3. 1 病毒培養

    Hep - 2 細胞在培養瓶中長至 70% ~ 80% 融合,吸出培養基,取病毒懸液 100 μL 接種于細胞上, 吸附 2 h 后倒出病毒液,加入 5% 胎牛血清的培養基,于第 2 ~ 3 天開始出現細胞病變( CPE) ,待病變達 60% ~ 70% 時 收獲病毒,細胞病變法( cytopathic effect,CPE) 測定病毒感 染滴 度,Reed - Muench 公式計算病毒半數細胞感染量 ( TCID50 ) 。1 TCID50≈0. 7 空斑形成單位( plaque forming unit,pfu) 。

    1. 3. 2 感染后咳嗽模型的制備

    將豚鼠放入自制 450 mm × 450 mm × 900 mm 熏籠中,每 5 只 1 籠,以鋸末 50 g + 10 支香煙點燃煙熏,每次 30 min,每日 1 次,連續 7 d,自由 進食吸水,分別在第 2 天、第 3 天用乙醚淺麻醉 1 次,鼻腔 滴入已事先擴增凍存好的病毒液,病毒滴度為 8 × 106 pfu / mL,滴入量以體質量 1 μL/g 計算。

    1. 3. 3 實驗動物分組及給藥方法

    將 40 只 SPF 級豚鼠適 應性飼養 1 周后,隨機分為 4 組,即空白組、模型組、射干組 ( 600 mg·kg - 1 ·d - 1 ) ,陽性組( 肺寧片 512 mg·kg - 1 ·d - 1 ) ,每組 10 只。按“1. 3. 2”制備感染后咳嗽動物模型, 除模型組外,其它各給藥組在第 8 天時開始給藥,每天 1 次,連續給藥 7 d,空白組給予等體積生理鹽水。

    1. 3. 4 對實驗動物鎮咳作用的觀察

    于末次給藥 45 min 時,將動物置于 5 L 大燒杯中,底部加少量墊料,燒杯口用 保鮮膜封,以 4. 5 mol /L 枸櫞酸溶液霧化吸入激發,每次 30 s,觀察 5 min 內豚鼠咳嗽次數。

    2 結果

    除空白組外,各組的肺組織均漿液在 Hep - 2 細胞上 培養至第 2 天細胞開始逐漸腫脹、變圓和聚集,細胞間隙增 大,第 4 天形成多核巨細胞或稱融合細胞。提示 RSV 病毒 感染成功。模型組豚鼠的咳嗽潛 伏期無顯著差異( P > 0. 05) ,而 5 min 內咳嗽次數顯著高于 空白組( P < 0. 01) ,提示造模成功。與模型組相比,給藥組 中,射干組和陽性組豚鼠 5 min 內咳嗽次數顯著降低( P < 0. 05) ,陽性組豚鼠 5 min 后咳嗽次數顯著下降( P < 0. 05) , 提示射干提取物對豚鼠 RSV 感染后氣道炎癥具有顯著的 鎮咳作用。空白組鏡下肺組織和肺泡結構正常, 有完整的支氣管上皮,黏膜較光滑,各層的結構比較清晰, 在支氣管壁內側未見到炎癥細胞的浸潤; 模型組在鏡下觀 察到顯著地支氣管、支氣管周圍炎癥,其血管周圍有很多炎 性細胞浸潤,觀察到支氣管黏膜充血水腫,管腔內有上皮細 胞脫落,有纖毛倒伏上皮現象,明顯可見中性粒細胞和淋巴 細胞有圍管性浸潤; 而射干組和陽性組與模型組比較,支氣 管和周圍炎癥較上述病理變化均有所減輕,提示射干提取 物對呼吸道合胞病毒感染后氣道肺組織損傷有一定的治療 作用。

    3 討論

    感染后咳嗽又稱為“感冒后咳嗽”,是指呼吸道 感染發熱等急性期癥狀消失后,咳嗽仍遷延不愈,可持續 3 ~ 8 周的時間,呈喉癢、干咳或咳少量白色黏液痰,血常規、 C 反應蛋白、胸片提示無異常,是呼吸道感染后常見的并發 癥。西醫認為該病為自限性疾病,很多權威學者一致認 為炎癥因素、氣道上皮損傷、氣道高反應性、神經因素等是 感染后咳嗽的發病機制,通常經過長時間自行緩解或予經 驗性治療可愈。




     


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