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    培養箱對于茄子冷誘導轉錄因子的分析

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-09-12 10:43【

    茄子(Solanum melongena)是亞洲和非洲許 多國家重要的蔬菜作物之一,在我國各地普遍栽 培。茄子作為一種喜溫性蔬菜,大多茄子品種不 抗寒。近年來,人們采用節能型塑料日光溫室 和塑料大棚在冬春反季節栽培茄子。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 植物材料

    將T40茄子6葉齡幼苗放在3 ℃ 低溫培養箱中進行低溫處理,于 0、2、6、12 h 分別 取樣。將茄子第 5 片真葉取下立即投入液氮中, −80 ℃保存備用。

    1.1.2 試劑與菌株

    ExTaq、pMD18-T、T4 DNA 連接酶載體購自 TaKaRa 公司;柱式 DNA 膠回收 試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司;SYBR ExScriptTM RT-PCR 購自 TaKaRa 公司;引物由上 海鉑尚生物技術有限公司合成。通用 RNA 提取試 劑盒 R1051 購自廣州東盛生物科技有限公司。 E. coli DH5α 菌株由本實驗室培養并保存。其余為 國產分析純試劑。

    1.2 方法

    1.2.1 茄子

    CBF基因的克隆與生物信息學分析 將白菜(Brassica rapa)CBF 基因序列(登錄號: KJ013591.1)搜索茄子基因組 DNA 序列,用 softberry 網站在線預測基因軟件 FGENESH 對這 段 DNA 序列進行基因預測,找到 CBF 基因的編碼區。參考茄子 EST 序列,通過與小白菜(Brassica campestris)、番茄(Solanum lycopersicum)、馬 鈴薯(Solanum tuberosum)CBF 基因序列比對確 定茄子 CBF 的開放型閱讀框區域(Open Reading Frame, ORF),并在此序列基礎上設計 ORF 上下 游引物和熒光定量引物(表 1)。

    參考 RNA 提取試劑盒步驟提取茄子葉片總 RNA,將 500 ng RNA 逆轉錄合成 cDNA。吸取 cDNA 1 μL 作為模板進行 PCR 擴增,25 μL PCR 反應體系包含 2.5 μL Ex buffer,2 μL dNTPs,0.2 μL ExTaq,0.5 μL 引物,1 μL cDNA,ddH2O 補 充至 25 μL。擴增程序為 94 ℃預變性 3 min;35 個擴增循環的 94 ℃變性 30 s,55 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 1 min;最后 72 ℃繼續延伸 7 min。然后, 將 PCR 產物用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,將含 有目的條帶片段割膠回收,再連接 pMD18-T 載 體,轉化到大腸桿菌感受態細胞中,挑選陽性克 隆送到鉑尚生物技術有限公司進行測序。

    2 結果與分析

    NCBI 上用白菜 CBF 基因序列(登錄號: KJ013591.1)搜索茄子 Whole-genome shotgun contigs ,發現該序列與茄子 contig: Sme2.5_ 04750.1_1(登錄號:BAUE01047055.1)相似度 最高,達 71%。在 softberry 網站,以番茄基因組 DNA 為參照,用 FGENESH 軟件對該序列進行基 因預測,在 1023~2137 bp 之間有 1 個沒有內含子 的基因。將該基因序列與 Genbank 登錄的基因組 序列,以及 3 個 EST 序列(EST1:FS056692.1; EST2:JZ716995.1;EST3:FS057826.1)進行比 對,設計 ORF 引物 CBF-U 與 CBF-D。以茄子葉片 cDNA 為模板,用 CBF-U 和 CBF-D 引物進行擴增,獲得長約 700 bp 的片段。經回收、測序長 699 bp,與基因組 DNA 序 列完全一致。將此序列及其編碼的氨基酸序列與 其他物種 CBF 比較,發現有較高同源性,該序列 ( Solanum melongena , AVC18973.1 )與辣椒 (Capsicum annuum,NP_001311786.1)、煙草 (Nicotiana tabacum,NP_001312746.1)、番茄(Solanum lycopersicum,XP_004234350.1)、馬 鈴薯(Solanum tuberosum,ACJ26754.1)和葡萄 (Vitis vinifera,XP_002280097.1)的 CBF 蛋白同 源性為 71.17%、70.09%、65.93%、63.76%、62.84% 。因此確認獲得了茄子 CBF 基因全長 cDNA 序列,將其命名為 SmCBF,GenBank 登錄 號為 KY780486.1。


    3 討論

    低溫逆境是影響植物生長發育和分布的主要因素之一,每年因寒害造成的園藝作物的減產和 品質下降是目前園藝植物生產中亟待解決的一大 難題。植物的抗寒性一般受多基因控制,且與品 質優劣性狀緊密連鎖,因此采用常規雜交育種很 難提高植物抗寒性。利用基因工程改良植物的抗 逆性為抗性育種開辟了新途徑,因此抗逆基因的 克隆與分析就顯得極為重要。




     


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