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    博迅培養箱在次級代謝潛力評估中的使用

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-08-22 11:38【

    多藥耐藥病原菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)、耐青 霉素肺炎鏈球菌(penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae,PRSP)、耐多藥結核分枝桿菌(multiple drugs resistant tuberculosis,MDR-TB)等革蘭氏陽性菌和耐碳青霉烯類鮑 曼不動桿菌(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii, CRAB)、超廣譜β-內酰胺酶(extended spectrum β-lactamases,ESBL)腸桿菌等革蘭氏陰性菌,其介導的感染性疾病是當今世界需要亟待解決的健康安全問題。



    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 材料


    土樣:32份試驗土樣采集于貴州遵義鳳凰山公園(10份)、 赤水丹霞山(12份)、大板水國家森林公園(10份)周邊人員 活動較少地區、海拔500~1 000 m左右的除地表腐殖質 10~20 cm的土層,分裝于無菌樣品采集袋中常溫保存運輸。



    1.1.2 菌株

    耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)31:由本實驗室保藏。



    1.1.3 培養基

    改良高氏1號培養基:可溶性淀粉20 g,NaCl 0.5 g,KNO3 1 g,K2HPO4 ·3H2O 0.5 g,MgSO4 ·7H2O 0.5 g,FeSO4 ·7H2O 0.01 g,玉米汁50 mL,土壤浸出物50 mL,土壤樣品細粉 10 g,復合維生素浸提物10 mL,瓊脂18 g,蒸餾水1 L,pH 7.2,115 ℃高壓滅菌30 min。其中玉米汁的制備:稱取新鮮 的玉米100 g,加入1 L蒸餾水,用豆漿機攪拌均勻后,濾掉 廢渣,補加蒸餾水至2 L,經微孔濾膜過濾除菌后于4 ℃冰 箱保存備用;復合維生素浸提物的制備:取21金維他多維 元素片20片(0.825 g/片)研磨成粉,入15 mL無水乙醇和35 mL無菌水振蕩懸浮,8 000 r/min離心10 min,上清用微 孔濾膜過濾除菌后于4 ℃冰箱保存備用。 土壤浸汁腐殖酸培養基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g, 微量元素預混液(ZnSO4 ·7H2O 2 g/L,FeSO4 ·7H2O 2 g/L, MnCl·2 4H2O 2 g/L,CuSO·4 5H2O 2 g/L,Na2B4O·7 10H2O 2 g/L, (NH4 )6Mo7O2·4 4H2O 2 g/L)0.5 mL,腐殖酸2.0 g,瓊脂18 g, 土壤浸出物1 L,pH 7.2,121 ℃高壓滅菌30 min。 國際鏈霉菌計劃(international Streptomyces project, ISP)2培養基:葡萄糖4 g,CaCO3 2 g,麥芽抽提物10 g,酵 母抽提物4 g,瓊脂15 g,蒸餾水定容至1 L,115 ℃高壓滅菌 30 min。 改良的葡萄糖酵母麥芽(glucose yeast malt,GYM)鏈 霉素培養基:葡萄糖4 g,CaCO3 2 g,麥芽抽提物10 g,酵 母抽提物4 g,微量元素預混液0.5 mL,腐殖酸浸出液10 mL, 瓊脂18 g,蒸餾水定容至1 L,115 ℃高壓滅菌30 min。 GYM液體培養基:葡萄糖4 g,酵母提取物4 g,麥芽提 取物10 g,蒸餾水定容至1 L,115 ℃高壓滅菌30 min。 LB液體培養基:胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,蒸餾水定容至1 L,121 ℃高壓滅菌30 min。LB固體培 養基:在LB液體培養基中加入瓊脂20 g。



    1.1.4 主要試劑

    抗生素、抗菌藥物儲存液(重鉻酸鉀50 mg/L,制霉菌 素20 mg/L,萘啶酮酸20 mg/L,放線菌酮50 mg/L):德國 Sigma公司;酚、氯仿等脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)提取試劑:北京索萊寶科技有限公司;乙酸乙酯、甲 醇(均為分析純):成都科龍化工試劑廠;Ex Taq酶(5 U/μL)、 脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate, dNTP)Mixture、Taq Buffer等分子生物學試劑及酶類:寶 生物工程(大連)有限公司。



    1.2 儀器與設備

    BSP-400培養箱:上海博迅醫療生物儀器股份有限公 司;E002092超級潔凈工作臺:蘇州市金凈凈化設備科技有限公司;Direct-Q5UV超純水機:美國密理博公司;MLS3781L-PC自動蒸汽滅菌器:日本松下公司;T100快速梯度 PCR儀:美國伯樂公司;Gel Doc XR+凝膠成像系統:美國 伯樂公司;DYCP-33A電泳儀:北京六一生物科技有限公司。



    1.3 方法

    土壤樣品預處理:每份樣品分別稱2 g于無菌研缽中, 加入0.2 g CaCO3,用無菌杵研磨成細粉,裝入50 mL無菌離 心管中,28 ℃風干2周后,加入30 mL無菌水,置于28 ℃搖床 上150 r/min振蕩1 h使土壤充分懸浮,55 ℃處理20 min,促 使放線菌孢子萌發。 菌株的分離純化:采用梯度稀釋法將土壤預混液分別 稀釋成10-2 、10-3 和10-4 3個濃度梯度,振蕩混勻,分別吸取不 同濃度梯度的土樣懸濁液200 μL均勻涂布于4種放線菌分離培養基(改良高氏1號培養基、土壤浸汁腐殖酸培養基、 ISP2培養基、改良的GYM鏈霉素培養基)上,28 ℃靜置培 養,隨時觀察培養基上的菌落生長狀態,挑取目的菌株進 行分離純化并保藏。



    2 結果與分析

    從采集的32份土樣中共分離到169株放線菌菌株,其中赤水丹霞山土樣65株(以CS命名菌株)、鳳凰山公園土樣 45株(以FHS命名菌株)、大板水國家森林公園土樣59株 (以DBS命名菌株)。采用瓊脂擴散法對分離菌株的抗MRSA 活性進行測定。不同分離菌株具有不同程度的抗MRSA 活性,且分離的169株菌株中有68株具有抗MRSA活性,占 總分離菌株的40.24%。因此,以68株活性抗MRSA菌株進 行后續的基因組勘探。同時Blast比對中,菌株DBS8-4、DBS8-13、CSGY1-11、 CSHG2-5、CSDG1-2、CSDG5-5、CSGY1-3、CSGY5-3、CSGY 1-9、FHS4-7與NCBI的GenBank數據庫中已有菌株的16S rRNA 序列相似性<98%,說明本地區土壤放線菌中可能蘊藏潛 在的較新穎菌株,具有開發的潛力。CHRISTIANSEN G等指出鹵化酶基因、聚酮合酶基 因、非核糖體肽基因等可以作為指示基因對微生物產次級 代謝產物的潛力進行快速評估。利用微生物的基因組信息 預測其合成特定天然產物的潛能,進而進行新化合物分離 純化和結構鑒定的基因組挖掘技術。



    3 結論

    本研究從32份土樣中共分離純化到169株放線菌,其 中68株菌株具有抗MRSA活性,占總分離菌株的40.24%。通 過16S rRNA序列分析可知,68株活性菌株主要為鏈霉菌 屬(Streptomycessp.),其中菌株DBS8-4、DBS8-13、CSGY1-11、 CSHG2-5、CSDG1-2、CSDG5-5、CSGY1-3、CSGY5-3、CSGY 1-9、FHS4-7 與 NCBI 的 Genbank 數 據 庫 中 已 有 菌 株 的 16S rRNA序列相似性<98%,說明本地區土壤放線菌中可 能蘊藏潛在的較新穎菌株,具有開發的潛力。 通過對68株活性菌株的次級代謝產物基因的勘探可 知,Hal陽性菌株占17.65%,PKS I陽性菌株占36.47%,PKS II 陽性菌株占61.77%,NRPS陽性菌株占32.35%,其中菌株 DBS9-1、DBS12-6、DBS8-13、DBS22-6、CSDG1-2、FHS5-10、 FHS10-22中同時含有NRPS或Hal、PKSI、PKSII三種基因, 本實驗可為后續通過激活特定合成的基因組定向挖掘該 類化合物等研究提供參考。






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