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    用博迅水槽對石蛙皮中膠原蛋白提取分析

    返回列表 來源:未知 發布日期:2020-01-07 09:21【

    1 儀器與試劑 


    1.1 儀器 


    BSA2214 型天平(賽多利斯),SK8210LHC 型超聲波清洗儀(上 海科導超聲儀器有限公司),DGG-9070A 型電熱恒溫鼓風干燥箱 (上海森信實驗儀器有限公司),WFZ UV-2000 型紫外可見分光光 度計(尤妮柯(上海)儀器有限公司),JY1002 電子天平(上海舜宇恒 平科學儀器有限公司),SSW 型微電腦電熱恒溫水槽(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)。 


    1.2 試藥 


    預處理過的石蛙皮、L-羥脯氨酸標準品(上海金穗生物科技有 限公司)、對二甲氨基苯甲醛、高氯酸溶液、冰乙酸、正丙醇、正 丁醇、異丙醇、氯胺T、Na2CO3等均為分析純。 


    2 方法與結果 


    2.1 原理 


    該方法源于國標 GB/T9695-23-2008。樣品用硫酸在高溫下水 解,氧化羥脯氨酸,加入對二甲氨基苯甲醛顯色,在 558nm 波長 下進行測定。膠原蛋白含量%=試樣中羥脯氨酸的含量*11.1。 


    2.2 試劑 


    2.2.1 氯胺 T 溶液的配制 


    稱取 0.7g 氯胺 T,并用 50 mL 緩沖溶液溶解。 


    2.2.2 緩沖溶液(pH=6.8)的配制


     一水檸檬酸 26.0g,氫氧化鈉 14.0g 和無水乙酸鈉 78.0g,并 500 mL 水溶解上述所配試劑移入 1L 的容量瓶中,再加入 250 mL 正丙醇,用水定容。 


    2.2.3 顯色劑的配制 


    稱取 2g 對二甲氨基苯甲醛,并用 7 mL 的高氯酸溶液(60%(質 量分數))溶解,緩慢加入 13 mL 異丙醇。該試液必須在臨用前配 置。


    2.2.4 羥脯氨酸標準液的配制 


    首先稱取 50.1mg 羥脯氨酸于 100 mL 量瓶中,用水溶解,再 加硫酸溶液,用水定容。 


    2.2.5 羥脯氨酸標準溶液液的配制 


    先移取 2.50 mL 所配的羥脯氨酸標準液至 250 mL 量瓶中,用 水定容。分別精密吸取該溶液 5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL 置 50 mL 量瓶中,水定容,所得羥脯氨酸標準工作液的濃度 依次為 0.501 μg/mL、1.002μg/mL、1.503μg/mL、2.004μg/mL、2.505μg/mL。該試液在臨用前配用。 


    2.3 樣品的處理


     (1)稱取 2.2g 試樣于燒瓶中,應避免試樣粘在燒瓶壁;再量取 30 mL 的硫酸溶液(3mol/L),加入燒瓶中,用表面皿蓋住,恒溫于 105℃的干燥箱中 16h。趁熱過濾至 250 mL 量瓶中,并用 10 mL 硫酸溶液洗滌,洗滌液并入量瓶中,用水定容,搖勻。精密移取 4 mL 酸水解液至 250 mL 量瓶中,定容,搖勻,即得。 (2)移取 4 mL 樣品溶液于比色管中,加入 2 mL 氯胺 T 試劑, 混合后,于室溫下放置 20min。在比色管中加入 2.00 mL 顯色劑, 混合,封住比色管的瓶口并迅速放入 60℃水浴中加熱 20min。取 出比色管,用流動水冷卻比色管不少于 3min,在室溫下靜置 30min。取上述澄清液體,用水作參比,于 558nm 處用分光光度 計測定吸收值,將檢測出的吸收值扣除空白溶液的吸收值,從 3.5 所得標準曲線計算得到羥脯氨酸的含量。


    3 膠原蛋白的提取工藝條件篩選 


    在料液比 1∶15(溶劑為 0.5mol/L 的乙酸溶液)下,加入石蛙 皮質量 2.5‰的胃蛋白酶,提取 24h,溫度分別在 10℃、15℃、20℃、 25℃、30℃、35℃時進行提取。當溫度由 10℃上升到 25℃過程中,膠原蛋白得 率上升幅度明顯;當提取溫度再繼續上升,膠原蛋白得率緩慢增 加。據有關報道,水產膠原蛋白變性溫度較低,大約在 37°左右, 基于這一點,石蛙皮中膠原蛋白的提取溫度選擇 25℃為宜。酶濃度的變化對石蛙皮中膠原蛋白得率有一定 的影響,當酶的添加量上升,膠原蛋白得率也不斷增加,直到酶 的添加量達到 3‰之后,膠原蛋白得率基本趨于穩定,不再顯著 上升,所以確定酶添加量的最佳值為 3‰。


    4 討論


     (1)通過對石蛙皮中的膠原蛋白的提取,利用酸酶結合的方 法,以及利用紫外分光光度計檢測羥脯氨酸的含量,最終換算出 蛙皮中膠原蛋白的得率。但其試驗并沒有測出膠原蛋白的類型, 也需要更進一步的精制。 (2)同時在進行紫外分光檢測時,觀察到部分溶液由混濁現 象,則應該等溶液反應澄清或使用超聲波促進溶解,過濾或加熱 處理,待溶液澄清了再進行測定。 (3)實驗研究了對提取膠原蛋白的多種影響因素,經過篩選, 提取工藝為:胃蛋白酶加入量為 3.0‰;酶解溫度為 25℃;酶解 時間為 24h;料液比為 1∶20。該工藝穩定可行,可用于石蛙皮中 膠原蛋白的提取。




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