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    耐熱蛋白酶產生菌的酶學性質研究-博迅滅菌器使

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-12-26 14:13【

    蛋白酶在科學研究和工業生產等方面應用廣 泛(唐兵等,2000),其主要產自微生物,但在高溫、 強酸、強堿、多金屬離子等條件下酶的催化活性并 不好,常有失活情況發生(林影等,2000)。 高溫蛋 白酶的應用前景十分廣闊(廉立慧等,2011),但國 內對高溫蛋白酶產生菌的研究相對較晚, 對高溫 蛋白酶催化活性方面的研究還鮮有報道。


    1 材料和方法 


    1.1 試驗材料 


    1.1.1 土壤樣品 


    土壤樣品來自大理彌渡縣白總 旗熱泉的底泥,熱泉水溫 55 ℃。 


    1.1.2 主要儀器 


    顯微鏡(奧林巴斯);紫外可見 光分光光度計(上海菁華儀器公司);高速冷凍離 心機(上海安亭科學儀器公司);恒溫培養箱(上海 一恒科學儀器有限公司);水浴恒溫搖床(常州國 華電器有限公司);高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅醫療生物儀器股份有限公司);超凈工作臺(蘇州凈 化設備有限公司);PCR 擴增儀(美國 ABI);電泳 儀(北京六一生物科技有限公司)。 


    1.1.3 試劑 


    酵母抽提物、蛋白胨為英國進口;瓊 脂粉為西班牙進口分裝;脫脂奶粉、三氯乙酸、folin 試劑、濃鹽酸、干酪素、氯化鈉、結晶紫、碘、乙醇、 孔雀綠、番紅等均為國產分析純試劑。DNA 抽提試 劑盒、PCR 擴增試劑盒、 膠回收試劑盒和 DNA 分 子量標準品均購自北京天根生物技術有限公司。


    1.1.4 培養基 


    脫脂奶粉培養基:脫脂奶粉 50 g, 水 500 mL,瓊脂粉 10 g,100 ℃滅菌 20 min。 LB 液體培養基:胰蛋白胨 10 g,酵母浸出物 5 g,NaCl 10 g, 超純 水 1000 mL, 調 pH 至7.2, 121 ℃滅菌 20 min。 發酵產酶培 養基:豆粕 20 g,葡萄糖 1 g,蒸 餾水 200 mL,121 ℃滅菌 20 min。 


    1.2 試驗方法 


    1.2.1 菌株富集 


    稱取白總旗熱泉底泥 2 g 于 45 mL 的無菌蒸餾水中,150 r/min,振蕩 15 min。在無 菌條件下, 用移液槍吸取 5 mL 懸液于 50 mL 的 富集培養基中,將接種好的富集培養基置于 55 ℃, 轉速為 150 r/min 的水浴恒溫振蕩培養箱中振蕩 培養 24 h。 


    1.2.2 菌株初篩 


    將富集好的菌液稀釋至 10-3 、 10-6 、10-9 倍, 用移液槍分別吸取稀釋的菌液 150 μL 接種在篩選培養基平板上,涂布均勻。 于 37 ℃倒 置培養 24 h。 觀察菌落周圍若有水解圈出現,說 明該菌株能產生蛋白酶。 


    1.2.3 菌株復篩 


    將初篩得到的菌株取少量接種 于種子瓶(LB 液體培養基),55 ℃培養 24 h 后,將 種子液按 2%的接種量接入到發酵培養基,55 ℃、 150 r/min 水浴搖床培養一周。 離心取上清測酶活。


    2 結果與分析 


    2.1 產酶菌株的篩選 


    根據水解圈直徑與菌落 直徑比值的大小。篩選到 3 株產高溫蛋白酶菌株。 其中 1 號菌株 水解圈直徑 與 菌 落 直 徑 比 值(R1/ R2)最大。 經復篩發現 3 株菌均為分泌型蛋白酶 產生菌,且 1 號菌株酶活最高,為 49.99 U/mL,與 初篩的結果相符。因此,選擇 1 號菌株作為后續試 驗研究菌株,命名為 Pro-55。 


    2.2 菌種鑒定 


    2.2.1 形態學、 生理生化特征 


    Pro-55 在 LB 培 養基上 37 ℃培養 72 h 后, 菌落形態呈圓形,黃 色,不透明,黏稠,光滑,表面濕潤,中間隆起,邊緣 整齊, 菌落整體較小未產菌絲。 革蘭氏染色呈陽 性,端生芽孢,鞭毛染色后未觀察到鞭毛。 對 Pro-55 的生 理 生 化 特 性 進 行 研 究 發 現, V-P 試驗、甲基紅試驗、蔗糖發酵試驗結果均為弱 陽性。明膠試驗、吲哚試驗、乳糖發酵試驗、葡萄糖 發酵試驗結果均為陰性。 


    2.2.2 16S rRNA 基因序列及系統發育分析 


    16S rRNA 基因測序, 所獲得的序列長度為 1438 bp, 將 Pro-55 的 16S rRNA 基因 序 列 與 GenBank 數 據庫中的序列進行同源性比對,發現 Pro-55 與短 芽 孢 桿 菌 屬 的 16S rRNA 基 因 序 列 自 然 聚 類 , Pro-55 的 16S rRNA 基因序列與 16 條相似性較 高的序列構建系統發育樹見圖 1, 從圖中可以看 出 Pro -55 與 Brevibacillus sp. FJAT -21992 (KP728965.1)菌株聚為一群,相似性也最高,表明 Pro-55 與 Brevibacillus sp.的菌株親緣關系最近。 根據 Pro-55 的形態及生理生化特征, 結合 《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第八版)(布坎南,1984), 以及 Pro-55 16S rRNA 基因序列及系統發育樹, 將 Pro-55 初步鑒定為短芽 孢桿菌屬(Brevibacillus sp.) 的一 株 菌, 命 名 為 Brevibacillus sp.Pro


    2.3 菌種的最適生長溫度 


    按照試驗方法,在波 長 600 nm 處測定不同溫度培養下 LB 培養基的 吸光值,以 600 nm 處的吸光值為縱坐標,溫度為 橫坐標作溫度—吸光值關系曲線,結果如圖 2。

    從圖 2 可知,25 ~ 43 ℃菌株的生長量隨著溫 度 的 升 高 而 增 加,43 ℃時,LB 培養 基 在 600 nm 下的吸光值最高,表明 43 ℃是菌株的最適生長溫 度。 45 ℃以后,菌株生長量隨著溫度的升高而下 降,菌株在 55 ℃下仍能生長,表明菌株屬于典型 的耐高溫菌。


    3 結論 


    高溫蛋白酶是一類廣泛應用于醫藥、食品、日 用化工等方面且有著巨大開發潛力的酶, 在微生 物體內廣泛 存在 (徐輝 艷 等,2009; 胡青 平 等, 2005)。 本次試驗得到的菌株經分子鑒定為短芽 孢桿菌;其最適生長溫度為 43 ℃,酶反應最適溫 度 40 ℃,酶反應最適 pH 為 6.0,在最適反應溫度 下酶活力為 36.74 μg/mL; 在 37 ℃以下酶具有較 好的熱穩定性。 Ca2+ 、Zn+ 、Mg2+ 、Cu2+ 等離子對酶液 的酶活性均有促進作用, 同時酶液具有很強的離 子耐受力。本文所篩選菌株在 55 ℃高溫下依然具 有較強的酶活力,且溫度耐受性較強。 




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