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    代謝產物芍藥苷的藥動學研究

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-12-02 10:01【

    苯甲酰芍藥苷是一種單萜苷類化合物,主要分布 在毛茛科植物芍藥、牡丹等的根部,具有改善心 肌缺血、抗炎、抗病毒、免疫調節、緩解阿爾茨海 默癥、清除過氧亞硝基等多種藥理作用 。Cheng 等給大鼠灌胃 110 mg·kg-1 的苯甲酰芍藥苷,利用 HPLC 檢測血漿樣品,無法測得原型藥物;周曉雯 等分別給大鼠灌胃和注射苯甲酰芍藥苷,發現苯甲 酰芍藥苷的生物利用度僅為 1.67%,猜測苯甲酰芍藥 苷灌胃給藥后會在體內迅速發生代謝轉化,導致其 生物利用度低。

    1 材料

    1.1 動物

    Sprague-Dawley 大 鼠 , 雄 性 , SPF 級 , (230±20)g,由安徽醫科大學實驗動物中心提供,許 可證號:SCXK(皖)2017-001。

    1.2 藥物及試

    苯甲酰芍藥苷(由本實驗室自制, 純度≥ 98%);芍藥苷(北京世紀奧科生物技術有限公 司,批號:17031901);肝素鈉注射液(江蘇萬邦生 化醫藥股份有限公司,批號:1406109);羧甲基纖 維素鈉(天津市致遠化學試劑有限公司,分析純,批 號:20170801);胃蛋白酶(上海源葉生物科技有限 公司,批號:Y20M9J56420);胰蛋白酶[生工生物工 程(上海)股份有限公司,批號:E116BA0104];氫氧 化鈉(煙臺市雙雙化工有限公司,分析純,批號: 20180201);磷酸二氫鉀(北京千年健中生物科技有 限公司,分析純,批號:20180112)。乙腈(批號: 18015097)、甲醇(批號:10962907829),色譜純, 德國默克公司;鹽酸(上海博河精細化學品有限公司,分析純,批號:20171006);甲酸(上海阿拉丁 生 化 科 技 股 份 有 限 公 司 , 色 譜 純 , 批 號 : A1627009);磷酸(天津市光復精細化工研究所,色 譜級,批號:20170101)。

    1.3 儀器

    UItiMate 3000 超高效液相色譜系統(LPG3400RS 四 元 泵 , VWD- 3400RS 檢 測 器 , TCC3x00RS 柱溫箱,Chromeleon 7 色譜工作站,美國賽 默飛世爾科技公司);ACQUITY H-CLASS UPLC 超高 效液相色譜系統,Xevo G2 Q-TOF 高分辨質譜儀(美 國 Waters 公司);H1750R 高速冷凍離心機(湖南湘儀 實驗儀器開發有限公司);MTN-2800N 型氮吹濃縮 裝置(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);MixMax 渦旋 振蕩器(合肥艾本森科學儀器有限公司);JK-250DB 型數控超聲波清洗器(合肥金尼克機械制造有限公 司);OHAUS EXPLORER 準微量天平(美國奧豪斯公 司);BSD-TX318 臺式恒溫振蕩器(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)。

    2 方法及結果

    2.1 苯甲酰芍藥苷體外代謝轉化研究

    2.1.1 色譜條件

    色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱(2.1 mm ×100 mm,1.7 μm);流動 相: 0.1%的甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0 ~1 min,8%~15% B;1~8 min,15%~18% B;8~10 min,18% ~30% B;10~15 min,30% ~35% B;15~ 20 min,35%~85% B;20~21 min,85%~8% B);流 速:0.2 mL·min-1 ;進樣體積:2 μL;柱溫:30 ℃。

    2.1.2 質譜條件

    采用 Waters-Xevo G2 Q-TOF 質譜 儀,配有 ESI 電噴霧離子源,負離子模式下進行檢 測,選用亮氨酸腦啡肽作為校正液。霧化氣(N2)體積 流量:600 L·h-1 ;錐孔氣流量:50 L·h-1 ;脫溶劑氣 溫度:350 ℃;離子源溫度(ESI- ):110 ℃;錐孔電壓:40 V;離子噴霧電壓(ESI- ):2.5 kV。MSE:掃 描模式檢測;低能通道碰撞電壓:6 V;高能通道碰 撞電壓:20~80 V;掃描范圍(m/z):0 ~1 500。

    2.1.3 人工胃液及人工腸液的配制

    取 2.34 mL 濃鹽 酸 加 水 定 容 至 10 mL 配 制 成 稀 鹽 酸 。 取 稀 鹽 酸 1.64 mL,加水約 80 mL 和胃蛋白酶 1 g,搖勻后, 加水定容至 100 mL,即得人工胃液,pH 值為 1.2。 取磷酸二氫鉀 0.68 g,加水 50 mL 使溶解,用 0.4% NaOH 溶液調節 pH 值為 6.8,另取胰蛋白酶 1 g,加 水使溶解,將兩液混合后,加水定容至 100 mL,即 得人工腸液。

    2.1.4 苯甲酰芍藥苷體外孵育實驗

    稱取適量苯甲酰 芍藥苷,配制成濃度為 7.5 mg·mL-1 的 0.5% 羧甲基 纖維素鈉混懸液。人工胃液組與人工腸液組各取苯 甲酰芍藥苷混懸液 1 mL,分別加入人工胃液及人工 腸液 5 mL,每組平行 6 份樣品,混勻后將其放入搖床中(37 ℃,轉速 200 r·min-1 ),分別于放入搖床的 0、0.5、1、4、8、12 h 取樣 200 μL,加入 1 mol·L-1 NaOH 調節溶液 pH 值至 7,加入 1 mL 乙腈混勻,使 酶失活;離心(1 000 r·min-1 ,15 min),取上清液過 0.22 μm 微孔濾膜;用 UPLC-Q-TOF-MS/MS 法檢 測,采用 MSE 模式采集質譜數據,結合牡丹皮質譜 圖庫并利用 UNIFI 系統對采集得到的質譜數據進行 自動識別。UNIFI 數據庫包括化合物名稱、分子 式、實際相對分子質量、理論相對分子質量、保留 時間、誤差、響應值等。依據碎片離子峰裂解規 律、化合物極性大小、數據庫信息及相關對識 別出的化合物信息進行鑒定和確認。人工胃腸液孵 育實驗所得總離子流圖見圖 1,說明苯甲酰芍藥苷 在人工胃液和腸液中不發生代謝轉化。結果只檢測 到苯甲酰芍藥苷原型,未檢測到代謝產物。


    3 討論

    UPLC-Q-TOF-MS/ MS 測定樣品時,流動相使用乙腈-0.1%甲酸水,得 到的總離子流圖基線平穩、峰形較好,且保留時間 穩定;但 UPLC 測定樣品時發現 0.1%甲酸水會使基 線漂移,所以對甲醇-水(含甲酸)、乙腈-水、乙腈水(含磷酸)等流動相系統進行考察, 結果發現乙腈0.05%磷酸水為流動相時基線不漂移,并且得到的色 譜峰分離度、峰形均較好,且保留時間穩定,所以 選擇乙腈-0.05%磷酸水作為 UPLC 的流動相。為確 保色譜峰的保留時間、峰形及分離度穩定,每次進 樣前色譜柱以流動相起始濃度平衡 5 min。



     


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