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    響應面法優化制備牡蠣短肽工藝

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-11-28 11:42【

    牡蠣俗稱生蠔、海蠣子,因肉質爽滑,味道鮮 美,營養豐富,被附以“根之源”“海洋牛奶”等 美譽。近年來,我國牡蠣行業產量呈現逐年上升 的趨勢,2018 年養殖量達 513.9 萬 t 。但是目前 國內牡蠣的應用仍以直接食用或制成調味料為主, 針對其精深加工技術與新型產品開發的進展較為 緩慢,因此,推動牡蠣深加工及綜合利用對其產業 的可持續發展具有十分重要的意義。一般來說,3 ~ 9 個氨基酸聚合而成的肽稱為短肽,其相對分子 質量范圍為180 ~ 1 000,介于氨基酸與蛋白質之間, 具有吸收好、代謝快、活性高等優點,是目前國內 外研究開發的熱點。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    香港牡蠣(Crassostrea hongkongensis),體質 量(20.56 ± 1.34)g,購于湛江市東風市場;菠蘿 蛋白酶(1.6×104 U/g)、木瓜蛋白酶(7.0×104 U/g)、 動物蛋白酶(6.8×104 U/g)、風味蛋白酶(7.0×104 U/g)、中性蛋白酶(6.3×104 U/g),南寧龐博生物工 程有限公司;Protamex(6.3×104 U/g)、Flavourzyme (5.9×104 U/g),諾維信生物技術有限公司;還原型谷胱甘肽(GSH),上海源葉生物有限公司;混合 氨基酸標準溶液,和光純藥工業株式會社;氫氧化 鈉、甲醛等分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

    1.2 儀器與設備

    PHS-25 雷磁 pH 計,上海康儀儀器有限公司; UV-8000 紫外分光光度計,上海元析儀器有限公 司 ;VAPODEST450 全自動凱氏定氮儀,德國 Gerhardt 公司;L-8900 全自動氨基酸分析儀,日立 高新技術公司;SHZ-水浴恒溫震蕩器,上海博迅醫療生物儀器股份有限公司;冷阱 CT-6、ZLS-1 型真 空離心濃縮儀,湖南赫西儀器裝備有限公司。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 牡蠣酶解液的制備

    牡蠣全肉經流水解凍 后打漿均勻,按料液質量體積比(g/mL,下同)1∶ 3 加水,調各酶最適 pH 值,8 000 r/min 勻漿 2 min, 加酶酶解后 100 ℃水浴滅酶 10 min,靜置冷卻至室 溫后以 8 000 r/min 離心 15 min,最后四層紗布過濾 獲取上清液,在-20 ℃下保存備用。

    1.3.2 高效蛋白酶的篩選

    選用 Flavourzyme、 Protamex、動物蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、 木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶,在各自最適條件下進行 酶解(表 1),以水解度、氮 N 回收率、短肽質量 濃度、短肽得率為指標綜合評價酶解效果。

    1.3.3 前處理對酶解效果的影響

    稱取牡蠣漿液40 g 放入 250 mL 錐形瓶中,按料液比 1∶3 加蒸餾 水后均質,分別采用熱處理(60、70、80、90、100 ℃ 下水浴保溫 10 min)和室溫 25 ℃下超聲波處理(功 率 500 W 處理 10、15、20 min,)兩種方式對牡蠣 勻漿液進行預處理,冷卻至室溫測 pH 值后加入動 物蛋白酶酶解 4 h,最后 100 ℃水浴滅酶 10 min 離 心取上清液,-20 ℃冷凍保存備用。.

    2 結果與分析

    2.1 不同蛋白酶酶解效果分析

    風味蛋白酶的水解度最高為(41.86 ± 3.62)%,動物蛋白酶略低,為(41.37 ± 1.19)%, 兩者無顯著差異(P > 0.05)。中性蛋白酶的 N 回收 率最高為(84.12±2.18)%,動物蛋白酶次之為(77.53 ± 0.49)%。由圖 1B 顯示結果可知,動物蛋白酶的 短肽質量濃度和短肽得率均顯著高于其他六種蛋 白酶(P < 0.01),分別為(15.68 ± 0.67)mg/mL, 34.79%。不同蛋白酶的酶切位點千差萬別導致酶解 效果的大不相同,動物蛋白酶本身是一種復合酶, 它既是內切酶又是外切酶,具有多種酶切位點,故 其酶解產物各項指標利用率高。因此,選取動物蛋白酶為酶解牡蠣的高效蛋白酶,進行下一步實驗。

    2.2 不同前處理對酶解效果的影響

    熱處理 10 min 后的動物蛋白酶 酶解產物水解度和 N 回收率均低于未處理,且隨著 溫度升高,牡蠣酶解產物的水解度和 N 回收率逐步 降低。這可能是因為加熱溫度過高或時間過長,都 會使已暴露出來的S—H氧化生成S—S或疏水相互 作用導致致密的網狀結構形成,導致眾多酶切位點 反而被包埋。郭玉華等研究顯示熱處理溫度越 高,牡蠣酶解產物的水解度越低;林海生等研究 表明熱處理組水解度均低于未處理組。本研究結 果與其結論相一致。圖 2A 顯示,酶解產物在 500 W 條件下超聲 10、15、20 min 后的水解度和 N 回收 率均低于未處理組。這可能是 500 W 超聲波過強且 超聲波過程中產熱導致牡蠣蛋白質結構被破壞,致 使蛋白酶酶解效率降低。

    3 結論

    本實驗確定牡蠣勻漿液經 80 ℃熱處理 10 min后加動物蛋白酶為制備牡蠣短肽的高效方法。確定 最佳酶解工藝條件,即料液比 1∶3.9,酶解溫度 47 ℃,動物蛋白酶加酶量 3 300 U/g,自然 pH 下 酶解時間 3 h,此條件下短肽得率達(58.53 ± 1.20)%,比傳統工藝的短肽得率提升 24.8%。該回 歸模型可靠,說明利用響應面法能有效優化制備牡 蠣短肽的酶解工藝。



     


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