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    發酵食品抗氧化乳酸菌的篩選(博迅SPX-250B-Z使用

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-11-18 10:33【

    1956年 英 國 學 者 Harmna首 先 提 出 了 自 由 基 衰老學說。自由基衰老理論(FRTA)認為細胞的老化變化是由自由基反應引起的。1990年 美 國 衰 老研究權威Sohal教授指出了自由基衰老理論的缺陷,并首次提出了氧化應激的概念。氧化 應 激 即 機體自由基生成增加或清除能力降低,引起機體氧 化系統和抗氧化系統的功能紊亂,導致自由基在體 內積累而引起的一系列氧化損傷過程。多種研究 證明:氧化應激不僅與衰老有著密不可分的關系,氧 化應激還與腫瘤的發生,哮喘、抑郁癥及各種慢性炎 癥等疾病息息相關。氧化應激還 參 與 心 血 管 疾 病的病理生理過程,引發動脈粥樣硬化、心力衰竭、 高血壓和心肌損傷等。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    傳統自制的發酵蔬菜:蘿卜、白菜、長豇 豆 和 芥 菜;嬰兒糞便,采 集 于25d健 康 嬰 兒;MRS液 體 培 養基:蛋白 胨 10.0g/L,牛 肉 膏 10.0g/L,酵 母 膏 10.0g/L,檸檬酸二銨2.0g/L,乙酸鈉5.0g/L,硫酸鎂0.58g/L,硫 酸 錳0.25g/L,磷 酸 氫 二 銨2.0 g/L,葡萄糖20.0g/L,吐 溫-801mL;二 苯 基 苦 基 苯肼自由基(Sigma生物試劑有限公司);DNA 抽提 試劑盒,由生工生物工程(上海)股份有限公司出品; API50試劑條(生物梅里埃中國有限公司);鄰菲羅 琳、過氧化氫、硫酸亞鐵和抗壞血酸等試劑(均為國 產分析純)。 生化培養箱(型 號 博迅SPX-250B-Z,上 海 博 迅 實 業 有限公司);紫 外/可 見 分 光 光 度 計(型 號 UV1000, 上海天美科學儀器有限公司);超聲波破碎儀(SON- ICS,型號 VCX500);臺式高速冷凍離心機(Ther- mo,型號Stratos);聚合酶反應 儀(Eppendorf,型 號 Mastercycler)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 樣品的采集

    使用一次性無菌注射器采集發酵蔬菜的湯汁, 保存于已滅菌的 EP管中。對嬰兒糞便進行無菌采 集,采樣后樣品封口膜封口,均保存于4 ℃備用。

    1.2.2 乳酸菌的分離純化

    將樣品用生理鹽水進行梯度稀釋,將稀釋后的 樣品均勻涂布于pH 為5.0的 MRS固體培養基上, 放入37 ℃普通培養箱培養24~48h。 觀察菌落形態,挑選符合乳酸菌形態的菌落進 行3次劃線純化。對純化后的菌落進行革蘭氏染色 和接觸酶實驗。革蘭氏染色陽性,接觸酶實驗為陰 性的菌株可初步判定為乳酸菌。

    1.2.3 乳酸菌耐受性實驗

    1)乳酸菌的耐酸性測定:將活化后的菌株,以 3%的接種量分 別 接 種 于 pH 為2.0,3.0,4.0,6.0 的 MRS液體培養基中,37 ℃培養16h。16h后測 其在600nm 處的吸光值。
    2)乳 酸 菌 的 膽 鹽 耐 受 能 力 測 定:將 活 化 的 菌 株,以3%的接種量接種于分別含有0,0.3%,0.5% 豬膽鹽的 MRS液體培養基中,37 ℃培養16h。16 h后測其在600nm 處的吸光值。
    3)乳酸菌的過氧化氫耐受能力測定:將活化的 菌株按3%接 種 于 過 氧 化 氫 濃 度 分 別 為 0.4,0.7, 1.0mmol/L的 MRS液 體 培 養 基 中,37 ℃培 養16 h。16h后測其在600nm 處的吸光值。

    1.2.4 乳酸菌體外抗氧化能力測定

    1)樣品的處理 樣品處理 參 考 Lin等的 方 法。完 整 細 胞 懸 液:將菌以1%接種于 MRS液體培養基,37 ℃培養 16h后4℃,4000r/min離心10min,棄上清,收集 菌體,收集的菌體經 PBS(pH 為7.
    2)洗滌3 次,再懸浮于 PBS中,調整菌數至1×109cfu/mL。 胞內提 取 物:將 上 述 菌 數 為1×109 cfu/mL 的 完整細胞懸液激進行超聲破碎,功率400 W,工作5 s,停5s,60 次。破碎后將懸液4 ℃,10000r/min 離心10min,收集上清。 2)DPPH 清除能力測定 取0.2mmol/mL 的 DPPH1mL,加1mL 處 理過 的 乳 酸 菌 樣 品 充 分 混 勻 后,室 溫 避 光 反 應 30 min,6000r/min離心10min,取上清,測定其在波 長517nm 處 的 吸 光 度 Ai,對 照 組(AO )以 等 體 積 PBS 代 替 樣 品。 以 等 體 積 PBS 和 無 水 乙 醇 調 0,其表達式為 清除率=AO-Ai AO ×100% 3)羥自由基清除能力測定 取1mL的鄰菲羅琳(2.5mmol/L),加入 PBS 1mL,蒸餾水1mL,充分混勻后加入1mL 硫酸亞 鐵(2.5mmol/L),再次充分混勻,加1mL過氧化氫 (濃度為20mmol/L)。將上述反應液于37 ℃水浴 1.5h后在536nm 處測定其吸光度 Ap;用1mL蒸 餾水代替過氧 化 氫 為 Ab;用1mL 樣 品 代 替1mL 蒸餾水為As ,其表達式為 羥自由基清除率=As-Ap Ab-Ap ×100% 4)抗脂質過氧化能力測定 在新鮮的雞蛋黃中1︰1加入 PBS,磁力攪拌 10min后用 PBS稀釋成1︰25的蛋黃懸液。取1 mL蛋 黃 懸 液,0.5 mL 樣 品,1 mL PBS 和 1 mL FeSO4(25mmol/L)溶液混勻,37℃保溫1.5h。然 后加入1mL三氯乙酸(TCA,質量分數為2.5%), 室溫靜置10min,3500r/min,離 心10min。取 上 清加入2mL 的 硫 代 巴 比 妥 酸(TBA,質 量 分 數 為 0.8%),充 分 混 勻 后 沸 水 浴 10 min;冷 卻 后 于 532 nm 處測定 吸 光 度 A1。A0 用等量的樣品溶劑(即 PBS)代替樣品,其表達式為 脂質過氧化抑制率=A0-A1 A0 ×100% 5)還原活性分析 在0.5mL的菌懸液中依次加入0.5mLPBS, 0.5mL鐵氰化 鉀(質 量 分 數 為1%),50 ℃水 浴20 min,迅 速 冷 卻 后 加 入 0.5 mL10% 的 三 氯 乙 酸, 4000r/min離心5min。取 上 清1mL 加 入1mL 蒸餾水和三氯 化 鐵(質 量 分 數 為0.1%)混 合 均 勻, 反應10min后于700nm 處測定其吸光值,用 L-半 胱氨酸作為標品。

    1.2.5 菌種鑒定

    1)16SrDNA:將乳酸菌ZJ401過夜培養后,取適 量菌液利用試劑盒提取全基因組。得到的全基因組用 16S通用引物進行PCR(27F:5'-AGAGTTTGATCCTG- GCTCAG-3';1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3'),將 PCR 產物送至公司進行測序。將測序結果在 NCBI上進行BLAST比對。 2)API50CH菌種鑒定:用 API50CH及 API50CHL 進行乳酸菌的生理生化鑒定,操作步驟按照說明書進行。 3)生長曲線分析:取50mL 已發酵24h的菌 液離心棄上清,用生理鹽水洗滌后再離心棄上清,置 于烘箱中烘干至恒重(65 ℃,24h),測其干重,以此 為依據分別計算出1,2,4,5,6,8,10mL發酵液 的菌體干重。另取1,2,4,5,6,8,10mL菌液, 離心棄上清后用生理鹽水重懸浮混 勻定容至 25 mL,分別測其 OD600nm,得到吸光值 OD600nm與菌體 干重的生物量標準曲線。另以1%的接種量將乳酸 菌ZJ401接種于 MRS液體培養基中,每隔2h取一 定量菌液進行OD600nm測定和pH 測定。

    1.2.6 統計分析

    每個實驗重復3 次,采用 SPSS19.0的單因素 方差分析顯著性差異。

    2 結果與討論

    芬頓反應是過氧化氫和二價鐵離子催化反應 生成具有強氧化能力的羥基自 由 基,目 前 芬 頓 反 正也廣泛應用于抗氧化能力的評價實驗中。乳酸菌要順利到達腸道,除了需要具有一定的耐 酸能力以外,還需要具有一定的膽鹽耐受能力,正常人 體腸道中膽鹽質量分數在0.03%~0.3%波動,乳酸菌 在此膽鹽濃度下具有活性就有可能在腸道中定植。DPPH(1,1-二 苯 基-2-三 硝 基 苯 肼)自 由 基 清 除實驗常用于抗氧化能力的評價實驗中。當 自 由 基 清 除 劑 存 在 時,DPPH 自由基接受一個 電子或 氫原子,形成穩定的 DPPH-H 化合物,使 其 乙 醇 溶 液從深紫 色 變 為 黃 色,變色程度與其 接受的電子 數量(自由基清 除 活 性)成 定 量 關 系,因 而 可 用 分 光光度計進行快速的定量分析。

    3 結 論

    隨著科技進步和生活水平的提高,細胞抗氧化 與抗衰老越來越多地為人們所關注。細胞氧化應激 損傷與衰老及多種疾病都有著密不可分的關系。本 實驗從各種發酵食品中篩選得到34株乳酸菌,經耐 酸耐膽鹽及耐過氧化氫實驗得到6株耐受性較好的 乳酸菌,通過 DPPH 清除率,羥自由清除率,還原活 性,抗脂質過氧化率實驗對菌株的體外抗氧化性進行了鑒定,確定了一株具有優良抗氧化性的短乳桿 菌,命名為ZJ401。ZJ401具備優良的體外抗氧化活 性和益生性能,為后續乳酸菌的菌種選育,食品發酵 工業中功能性抗氧化食品發酵劑的研制,以及新型 的益生活菌制劑的開發奠定基礎。

     


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