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    對小鼠腦缺血再灌注損傷分析(博迅水槽使用)

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-11-15 10:45【

    大腦短暫缺血性損傷或再通可見于頭頸部手術出現的 并發癥,腦血栓形成后部分腦血管的自然再通或者藥物溶 栓再通也會出現缺血再灌注損傷。在腦缺血再灌注損傷 時,大腦缺血邊緣區( 半暗區) 細胞以凋亡為主要死亡方式, 及時的藥物干預可以抑制細胞凋亡,因此該區域為腦缺血 以及再通后重點搶救區域。而海馬區對缺血缺氧相當敏 感,及時搶救海馬區的神經元凋亡,對保護海馬區的記憶、 學習功能有重要意義。

    1 實驗材料

    1. 1 動物

    SPF 級健康 6 周齡雌性昆明種小鼠 33 只,體質 量 22 ~ 30g,由廣州中醫藥大學實驗動物實驗中心提供,許 可證號: SCXK( 粵) 2013 - 0034。自由飲食飲水飼養,自然光 暗周期。

    1. 2 藥物與試劑

    三七總皂苷,云南玉溪萬方天然藥物有 限 公 司 提 供,規 格: 200mg /支,批 準 文 號: 國 藥 準 字 Z20026437; 兔抗小鼠 Bax 和 Bcl - 2 多克隆抗體,CST 公司 提供; SABC 免疫組化染色試劑盒,規格: 1kit,購自武漢博士 德生物試劑公司; DAB 顯色試劑盒( 20 × ) ,規格: 3ml,購自 北京索萊寶科技有限公司。

    1. 3 主要儀器

    光學顯微鏡( 日本 OLYMPUS 公司) ; 冰凍 切片機( 德國 LEICA 公司) ; 博迅SSW-600-2S電熱恒溫水槽( 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司) 。

    2 實驗方法

    2. 1 動物分組

    將實驗小鼠隨機分為空白組( 7 只) 、PNS 組( 8 只) 、缺血 9d 組( 9 只) 、缺血 24h 組( 9 只) 。

    2. 2 模型制備

    PNS 組、缺血 9d 組和缺血 24h 組參照相關中的方法改進制備缺血再灌注模型。稱小鼠體質量, 腹腔注射水合氯醛( 0. 003ml /g) 麻醉小鼠,待小鼠無翻正反射 后,固定于手術臺上,常規消毒,頸部切開 0. 8 ~ 1cm 正中切 口,剪毛,切開皮膚和皮下組織,鈍性分離肌肉,暴露頸動脈 鞘,然后分離雙側頸總動脈及迷走神經約 0. 5 ~ 1cm,并用絲 線穿過頸總動脈下方,提拉絲線,以動脈夾夾閉頸總動脈阻斷 血流 20min,然后去除,恢復灌注,最后縫合皮膚,消毒。

    2. 3 給藥方法

    PNS 組于缺血前 3d 開始腹腔注射 PNS 30mg /( kg·d) ,之后每天同一時間注射等體積 PNS,持續 至再灌注第 9 天后取腦。缺血 9d 組和缺血 24h 組均在造模 前 3d 以等體積的 0. 9% 氯化鈉注射液腹腔注射,之后每天 同一時間等體積注射 0. 9% 氯化鈉注射液,分別持續注射至 再灌注第 9 天和再灌注 24h 后取腦。空白組在缺血 9d 組造 模前 3d 以等體積 0. 9% 氯化鈉注射液腹腔注射,之后每天 同一時間注射等體積 0. 9% 氯化鈉注射液,持續注射至第 9 天后取腦。

    2. 4 觀察指標

    SABC 免疫組化方法: 獲得鼠腦后按冰凍 切片制作方法進行切片,厚度 30μm。按照 SA1020 - 小鼠/ 兔 IgG SABC 免疫組化染色試劑盒說明書進行染色,步驟 為消除組織內源性過氧化物酶、抗原修復、封閉、孵育一抗、 孵育二抗、孵育 SABC、DAB 顯色、脫水、透明、封片。其中每 組腦片分別進行 2 次免疫組化染色,分別孵育 Bax 抗體( 工 作濃度 1∶ 800) 和 BCL - 2 抗體( 工作濃度 1∶ 1600) 。其中, DAB 顯色法步驟按照 DAB 顯色試劑盒( 20 × ) 說明書進行, 具體步驟: 將工作 A 液、B 液、PBS 液按 50∶ 50∶ 900 稀釋并混 合,室溫避光孵育切片 30min,在顯微鏡下觀察顯色,用蒸餾 水洗滌終止反應。 陽性細胞計數: 在 200 倍光學顯微鏡下在腦組織切片的 海馬區內隨機選取 5 個視野計數免疫組化染色陽性的細胞 數。并分別記錄每組切片 Bax 和 Bcl - 2 免疫組化染色陽性 的細胞數。

    2. 5 統計學方法

    采用 SPSS 19. 0 統計軟件處理數據,2 組 間比較采用獨立樣本 t 檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,數據以均數 ± 標準差( x ± s) 表示。P < 0. 05 表示差異有 統計學意義。

    3 實驗結果

    各組小鼠海馬區 Bax、Bcl - 2 表達水平比較: 與空白組比 較,缺血 9d 組 Bcl - 2、Bax 水平均明顯增高; 與缺血 9d 組比 較,PNS 組 Bax 的表達水平明顯降低,Bcl - 2 /Bax 的表達水平 明顯增高; 缺血9d 組 Bax 和 Bcl - 2 的表達均較缺血24h 組增 高; 差異均具有統計學意義。( 見圖 1、圖 2) 表 1 各組小鼠海馬區 Bax、Bcl - 2 水平比較( x ± s,個) 組別 只數 Bcl - 2 Bax Bcl - 2 /Bax 空白組 7 2. 94 ± 2. 15 4. 00 ± 4. 10 0. 92 ± 0. 52 PNS 組 8 7. 30 ± 3. 75 3. 35 ± 1. 81 2. 26 ± 0. 70cd 缺血 9d 組 9 27. 44 ± 19. 59abd 63. 44 ± 12. 77abd 0. 46 ± 0. 32 缺血 24h 組 9 0. 58 ± 0. 88 1. 58 ± 1. 44 0. 61 ± 1. 11 注: 與空白組比較,a P < 0. 05; 與 PNS 組比較,b P < 0. 05; 與缺血9d 組比較,c P <0. 05; 與缺血24h 組比較,c P <0. 05。


    4 討 論

    PNS 具有廣泛的藥理作用,實驗研究證實其不僅能抑制 炎癥因子、清除自由基、抗氧化應激,還能通過活血化瘀、擴 張毛細血管,降低血管阻力及血液黏度,改善微循環,對腦 缺血再灌注損傷有保護作用,因此可用于缺血性腦血管疾 病的治療。黃小平等將三七的 3 種有效成分人參皂苷 Rg1、Rb1 以及三七皂苷 R1 分別與黃芪甲苷配對,然后注入 腦缺血模型小鼠后發現,注入人參皂苷 Rg1 的小鼠腦組織 中一氧化氮含量明顯降低,說明人參皂苷 Rg1 具有抗腦缺 血的作用,對再灌注后氧化應激損傷的亦有明顯的保護 作用。



     


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