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    三葉青多糖的工藝研究(博迅9070MBE使用)

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-11-13 10:37【

    三葉青(radixtetrastigmatishemsleyani),又名蛇附子、石老鼠、石猴子、石抱子等,為葡萄科崖爬藤 屬植物三葉崖爬藤。它主要分布于中國浙江、安徽、江西、云南、貴州等地,具有清熱解毒、消腫散結、活 血化瘀等功效。三葉青中含有多種有效的化學活性成分,多糖便是其中之一。研究表明,三葉青多糖 具有復雜的生物活性和功能,如降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗肝損傷、調節免疫等。目前研究人員提取三 葉青多糖的方法大多為傳統的水提醇沉法、酸堿提取法、索氏提取法等,這些傳統的提取方法普遍存在 提取溫度高、耗時長、效率低、溶劑消耗大且多糖的空間結構易被破壞等缺點。

    1 材料與儀器

    1.1 材 料

    纖維素酶(BR,國藥集團化學試劑有限公司,批號20180309);葡萄糖(AR,天津市大茂化學試劑廠);鹽 酸(AR,上海凌峰化學試劑有限公司);硫酸(AR,上海凌峰化學試劑有限公司);苯酚(AR,杭州雙林化工試 劑廠);1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH,AR,北京冬歌生物科技有限公司);無水乙醇(AR,永華化學科技有限公 司);FeSO4·7H2O(AR,天津市大茂化學試劑廠);水楊酸(AR,上海凌峰化學試劑有限公司);30%H2O2 溶 液(AR,杭州高晶精細化工有限公司);三葉青塊根(浙江麗水三葉青珍稀植物研究所,產地浙江麗水)。

    1.2 儀 器

    高速多功能粉碎機(永康市天祺盛世工貿有限公司,CS-700);電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限 公司,BS224S型);循環水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司,SHZ-DⅢ型);電熱恒溫水浴鍋(杭州藍天 化驗儀器廠,DKS-24型);752紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司);冰箱(博西華家用電 器有限公司,BCD-212型);數顯鼓風干燥箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠,9070MBE 型);pH 計 (上海佑科儀器儀表有限公司,PHS-3C型)。

    2 試驗方法

    2.1 標準曲線的建立

    2.1.1 標準溶液的制備

    準確稱取干燥至恒重的葡萄糖50mg于250mL容量瓶中,加去離子水溶解并稀釋至刻度,搖勻,配 得葡萄糖標準溶液(0.2mg/mL)。

    2.1.2 最大吸收波長的確定

    吸取1.0mL的葡萄糖標準溶液,置于10mL具塞試管中,加去離子水至2.0mL,加6.0%苯酚溶液 1.0mL后,立即加入5.0mL濃硫酸混勻,靜止10min,搖勻,室溫放置20min。同時取2.0mL去離子 水作為空白對照。在分光光度計上測定波長450~550nm 處的吸光度,確定其最大吸收波長。根據 試驗結果,吸收波長為492nm 時,樣品溶液的吸光度最大,故本試驗選取的吸收波長為492nm。

    2.1.3 葡萄糖標準曲線的繪制

    精確量取葡萄糖標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL,置于10mL具塞試管 中,加去離子水至2.0mL,加6.0%苯酚溶液1.0mL后,立即加入5.0mL濃硫酸混勻,靜止10min,搖 勻,室溫放置20min。同時取2.0mL去離子水作為空白對照,按上述方法操作,于最大吸收波長處測其 吸光度,并繪制葡萄糖標準曲線。

    2.2 纖維素酶法提取三葉青多糖的工藝流程

    將三葉青塊根用粉碎機粉碎,準確稱取三葉青粉末5.0g及適量的纖維素酶,加入一定量的稀酸液 并結合pH 計調節溶液pH 值為5,在一定溫度條件下提取三葉青多糖。一段時間后將其置于90 ℃水浴 鍋中滅活5min,再經過抽濾得到濾液,將濾液于250mL 容量瓶中定容,以用于接下來多糖提取率的測定。

    2.3 三葉青多糖提取率的測定

    三葉青多糖提取率的測定采用苯酚-硫酸法。從250mL容量瓶中取1.0mL試液于10mL容量 瓶中并定容。再從10mL容量瓶中精密移取0.5mL按2.1.3的方法測定樣品吸光度,并按式(1)計算 三葉青多糖的提取率: Y = [(C×V ×D)/M]×100%。 (1) 式(1)中:Y 為多糖提取率;C 為由標準曲線方程求得的多糖質量濃度,mg/mL;V 為待測液體積,mL;D 為稀釋倍數;M 為樣品質量,mg。

    2.4 單因素試驗設計

    在酶法提取三葉青多糖的過程 中,影響多糖提取率的主要因素 有酶 加 量、酶 解 時 間、酶 解 溫 度、 pH、水料比(體積∶質量,mL/g)、提取次數等。本試驗選擇酶加量、酶解溫度、酶解時間、水料比這 4個因素分別進行單因素試驗。通過多次的預試驗,對各單因素條件的固定提取條件進行了設置,具體見表1。

    3 試驗結果與分析

    以吸光度y值為縱坐標,葡萄糖質量濃度x 為橫坐 標,制作葡萄糖標準曲線,如圖1所示。標準曲線的回歸 方程為:y=57.767x-0.017,R2 =0.9994,表明吸光度 在葡萄糖標準溶液質量濃度為0.005~0.03mg/mL范 圍內線性關系較好。隨著酶加量的增加,三葉青多糖提取率 增大,這一階段影響三葉青提取率的主要因素是酶含量。當酶加量達到0.3%時,三葉青多糖提取率達到最大;之后再增大酶加量,三葉青多糖提取率反而有所降低。這是因為此時影響三葉青多糖提取率的 圖2 酶加量對三葉青多糖提取率的影響 Fig.2 Effectofenzymedosageonextractionyieldof polysaccharidefromradixtetrastigmatishemsleyani 主要因素是底物的量,此時酶的用量已達到飽和,沒有多 余的底物再有機會與纖維素酶反應;而且酶含量過高,也 可能會抑制酶的作用。因此,酶加量取0.3%。

    4 結 語

    采用纖維素酶法提取三葉青中的多糖,考察了酶加量、酶解溫度、酶解時間及水料比4個因素對 多糖提取率的影響。通過單因素試驗和響應面試驗設計,明確了各因素對三葉青多糖提取率的影響大小 次序為:酶加量>水料比 > 酶解時間 > 酶解溫度。最佳提取工藝條件為:酶加量 0.274%,酶解溫度 60.5 ℃,酶解時 間 62.4 min,水 料 比 25.8∶1,此 條 件 下 的 多 糖 實 際 提 取 率 為 10.47%。酶法提取三葉青多糖用時較短,提取率卻更高。本試驗得出的三葉青多糖提取優化工藝可為研 究與開發三葉青多糖提供試驗基礎。



     


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