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    米曲霉產氨肽酶的影響分析-LRH-250使用

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-11-05 10:18【

    醬油是傳統發酵調味品,具有悠久的歷史,深受我 國、日韓和 東 南 亞 各 國 人 民 的 喜 愛。米 曲 霉 是 醬 油釀造中最重要的微生物,菌絲生長迅速,成熟后呈現 黃 綠 色 孢 子,具有優良的胞外酶系分泌和食品安全性,主 要 產 生 蛋 白 酶、淀 粉 酶、糖 化 酶、纖 維 素 酶 等。米曲霉蛋白酶根據酶切方式可分為內切酶和外切酶兩大類,其中內切酶包括中性、堿性、酸性蛋白酶, 外切酶包括羧肽酶和氨肽酶。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌種

    Aspergillusoryzae:本 實 驗 室 保 存,斜 面4 ℃保 藏。

    1.1.2 主要材料與試劑

    馬鈴薯、麩皮、豆粕:市售,購于本地農貿市場。 葡萄糖、NaCl、磷 酸 二 氫 鉀、磷 酸 氫 二 鉀、三 羥 甲 基氨基甲烷、HCl:均 為 分 析 純,購自國藥集團化學試 劑有限責任公司;瓊脂:生化試劑,購自北京奧博星生 物技術有限責任公司;L-亮氨酸對硝基苯胺:分析純, 購自Sigma公司。

    1.2 儀器與設備

    LRH-250-2型恒溫培養箱上海博訊實業有限公司;HVE-FO 型高壓蒸汽滅菌鍋 金壇市恒豐儀器 廠;SW-CJ-2F型超 凈 工 作 臺 寧波新芝生物科技有 限公 司;PL403 型 電 子 天 平 梅 特 勒-托 利 多 公 司; 3110型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公 司;B-260型水浴鍋 上海醫療器械五廠。

    1.3 方法

    1.3.1 主要試劑的配制方法

    磷酸緩沖液的制備(pH7.5):使用電子天平準確 稱取磷酸 氫 二 鈉 6.02g 和 磷 酸 二 氫 鈉 0.5g 加 入 1000mL容量瓶中,然后加蒸餾水定容至1000mL。

    1.3.2 培養基的配制

    馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)的配制:將500g削 皮、干凈的土豆切碎置于1000mL 大 燒 杯 中,補 充 蒸 餾水 至1000mL,電爐加熱并維持煮沸狀態20min, 4層紗布過濾,用蒸餾水將濾液補充至1000mL,加入 葡萄糖和瓊脂粉各20g煮沸直至全部溶解,分裝于三 角瓶中,于121 ℃滅菌20min。 麩皮豆粕培養基的制備:準確稱量豆粕20g、麩皮 80g,添加1倍質量含不同鹽濃度的水混 勻。混 勻 后 分裝30g于250mL的三角瓶中,三角瓶中的鹽濃度 梯度為0、1%、3%、5%、7%(g/dL),于121 ℃高壓蒸 汽滅菌20min,滅 菌 后 搖 瓶,保 持 原 料 處 于 疏 松 的狀態。

    1.3.3 菌種的培養

    1.3.3.1 斜面培養

    將冰箱中4℃冷凍保藏的米曲霉菌種以無菌操作 的方式接種于新制備的 PDA 斜面培養基上,于30 ℃ 恒溫培養72h,備用。

    1.3.3.2 米曲霉的活化培養

    將斜面上培養的成熟的米曲霉用接種環以無菌操 作方式接種于 PDA 斜面培養基上,于30 ℃恒溫培養 箱中培養72h。

    1.3.3.3 制備孢子懸液

    取生長良好的試管斜面菌種,用磷酸鹽緩沖液輕 輕地將培養基上生長的米曲霉洗脫至裝有玻璃珠的 150mL無菌三角瓶中,震蕩20min 后用雙層紗布過 濾,然后使用血球計數板計數并 調整孢子濃度為 107 個/mL。

    1.3.3.4 米曲霉的制曲培養

    取適 量 孢 子 懸 液 以 無 菌 操 作 方 式 按 照 3% (mL/100g)的接種量接種于麩皮豆粕固體培養基上, 于37 ℃培養72h。

    1.3.4 氨肽酶粗酶液的制備

    取5g于37℃培養后的固體干曲,按照1∶20(g/mL) 加入0.1mol/LpH 值為7.5的磷酸鹽緩沖液,于40℃ 水浴中,間歇攪拌,浸提1h,用4層紗布過濾后即可獲 得氨肽酶粗酶液。

    1.3.5 氨肽酶酶活力的測定

    氨肽酶活力的測定采用亮氨酸對硝基苯胺法,以亮 氨酸氨肽酶酶活計。在 試 管 中 加 入2mL0.1mol/L pH7.5的磷酸鹽緩沖液,然后向緩沖液中加入1mL經 過稀釋一定倍數的米曲霉氨肽酶粗酶液,最后向緩沖液 中加入1mL的 L-亮氨酸對硝基苯胺,輕輕搖晃試管使 其充分混合均勻,于50℃水浴鍋中反應10min,立即取 出冰浴并于405nm處測量吸光值。 計算公式:X=105.7×4×N×Y/10000。 式中:X為氨肽 酶 粗 酶 液 的 酶 活 力;N 為405nm 處測定得到的吸光值;Y 為粗酶液的稀釋倍數。 氨肽酶酶活力的定義:將50 ℃反應條件下,每分 鐘催化 L-亮氨酸-對硝基苯胺產生1μmol對硝基苯 胺所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

    2 結果與分析

    在37 ℃下將米曲霉在含有不同 NaCl濃 度 (0、 1%、3%、5%、7%,g/100g)的麩皮豆粕固體培養基上 進行培養,米曲霉生長情況見表1。

    由表1可知,培養基中添加 NaCl對米曲霉的生長有 一定的影響。在麩皮豆粕固體培養基中 NaCl濃度由0 增加到3%的過程中,米曲霉的生長速度隨著鹽濃度增加 而提高。在 NaCl濃度為3%時,米曲霉培養72h出現大 量綠色孢子;而 NaCl濃度為0時,需培養84h才有大量 綠色孢子產生,由此推測培養基中 NaCl濃度為3%時,對 米曲霉的生長及產酶能力有一定程度的增強。當 NaCl 濃度超過3%時,米曲霉生長又會變得緩慢,即當 NaCl濃 度大于3%時,隨著鹽濃度的不斷升高,對米曲霉的生長 又表現出一定的抑制作用。

    3 結論

    試驗結果表明,NaCl對 米 曲 霉 的 生 長、米 曲 霉 產 氨肽酶能力以及米曲霉產氨肽酶活力都有一定影響。 在含有3% NaCl的培養基上培養,對米曲霉產氨肽酶 的能力有一定的促進作用,但在超過5% NaCl的培養 基上培養,對米曲霉產氨肽酶能力有明顯的抑制作用。 在磷酸鹽緩沖溶液中 NaCl濃度為0~10%時,隨著鹽 濃度的不斷 增 加,對氨肽酶活力有一定的促進作用, 10%時達到最高,培養72h酶活力為26.258U/mL, 較未 添 加 NaCl時酶活力提高了 5.29%,超 過 10% NaCl濃度對氨肽酶活力有明顯抑制作用。但 經 過 在 含 NaCl培養基 上 進 行 馴 化 培 養 后,米 曲 霉 氨 肽 酶 的 耐鹽性及活 力 都 得 到 一 定 的 提 升。3% NaCl濃 度 下 馴化培養后的米曲霉氨肽酶活力在15% NaCl濃度環 境中最高,為29.884U/mL,與未經 NaCl馴化培養相 比較,米曲霉氨肽酶最大酶活力提高了13.81%,鹽濃 度提高了5%。


     


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