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    尖吻蝮蛇毒對人卵巢癌細胞的抑制作用研究-博迅

    返回列表 來源:未知 發布日期:2019-10-31 14:09【

    卵巢癌為高度異質性腫瘤,在婦科惡性腫瘤發生率排名中位居第三(排名前兩位的依次為子宮內膜癌和宮 頸癌),致死率則居婦科惡性腫瘤之首。根據統計資料顯示,全世界每年診斷出的卵巢癌患者約有239000例, 而死于卵巢癌的患者約有152000人。

    1材料與方法

    1.1 材料

    成年尖吻蝮蛇購自湖南省湘西土家族苗族自治州烏龍山,采用咬皿法制備蛇毒,經冷凍干燥后置于-20 ℃ 低溫保存備用。A2780細胞購買于 AmericanTypeCultureCollection(Rockville,MD,USA)。

    1.2 儀器與試劑

    本研究所用的主要儀器為:GI54D高壓滅菌器(美國 ZEALWAY 公司)、高溫烘烤箱(上海精宏實驗設備有 限公司)、超凈工作臺(上海博訊實業有限公司)、TGL-16B臺式離心機(上海迪索儀器有限公司)、MCO-15AC二 氧化碳培養箱(日本SANYO 公司)、TH4-200倒置熒光顯微鏡(日本 OLYMPUS公司)、TGL-20高速冷凍離心 機(四川蜀科儀器有限公司)和酶聯免疫檢測儀(美國 Bio-Rad公司)。主要耗材與試劑為:25cm2 細胞培養瓶和 細胞培養板(美國 Corning公 司)、細 胞 計 數 板(上海新睿生物科技有限公司)、Basalmedium/DMEM-H(美 國 Genview 公司)、CellCountingKit-8(美國 Genview 公司)、FetalBovineSerum(美國 Sigma公司)、青霉素-鏈霉 素(美國 HyClone公司)、PhosphateBufferedSaline(PBS)(美國 HyClone公司)和 Trypsin0.25%(1×)Solution (美國 HyClone公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 細胞培養

    培養 A2780細胞時,培養液選擇 DMEM 培養基加質量分數為10%的 FetalBovineSerum 和 100U·mL-1的青霉素-鏈霉素,置于37℃、體積分數為5%的CO2 以及飽和濕度的培養箱中培養。A2780細胞 呈貼壁生長。后續實驗中,有關 A2780細胞的培養液配方以及培養箱中的理化參數均保持不變。

    1.3.2 不同質量濃度蛇毒對 A2780細胞的形態學影響

    采用徐平等人的方法并稍作修改:取對數期生長的 A2780細胞,經胰酶消化成懸液,使細胞密度為2.5×105個·mL-1,接種于24孔板中,置于培養箱中培養;細胞 貼壁后棄上清,用PBS清洗1次,每孔加入900μL培養液,再加入不同質量濃度的蛇毒樣品各100μL,使蛇毒的 終質量濃度分別為3.125,6.25,12.5,25,50,100和200μg·mL-1,而空白對照(蛇毒質量濃度為0)加入等量的 PBS,置于培養箱中培養12h,之后拍照記錄細胞形態變化。

    1.3.3 不同蛇毒作用時間對 A2780細胞的形態學影響

    仍然采用徐平等人的方法并稍作修改,且在加入蛇毒 前的操作步驟同1.3.2部分;然后加入蛇毒100μL 使蛇毒的終質量濃度為50μg·mL-1,以未加蛇毒為對 照 (即0h),置于培養箱中培養1,6,12h,并在以上時間點拍照記錄細胞形態變化。

    1.3.4 蛇毒對 A2780細胞增殖活力的影響

    采用CellCountingKit-8(CCK-8)試劑盒檢測蛇毒對 A2780細胞增 殖能力的影響,根據試劑盒說明書進行如下操作:取對數期生長的 A2780細胞,經胰酶消化成懸液,使細胞密度 為2.5×105個·mL-1,接種于96孔板中,置于培養箱中培養,細胞貼壁后棄上清;用 PBS清洗1次,每孔加入 90L培養液,再加入不同質量濃度的蛇毒樣品各10μL,使蛇毒的終質量濃度分別為3.125,6.25,12.5,25,50, 100和200μg·mL-1,空白對 照(蛇毒質量濃度為 0)加 入 等 量 的 PBS,每 組 6 個 復 孔;再 置 于 培 養 箱 中 培 養 12h,每孔加入10μLCCK-8,在培養箱中孵育1h;酶聯免疫檢測儀于450nm 波長檢測吸光度,采用以下公式進 行細胞增殖活力的計算: V=A2-A0 A1-A0 ×100%。 其中:V 為細胞增殖活力;A0 為有培養基、CCK-8但無培養細胞孔的吸光度;A1 為有培養細胞、CCK-8、PBS孔 的吸光度;A2 為有培養細胞、CCK-8溶液、蛇毒樣品孔的吸光度。

    1.3.5蛇毒對 A2780細胞粘附能力的影響

    在李博等人方法基礎上稍作修改:取對數期生長的 A2780細胞, 經胰酶消化成懸液,使細胞密度為2.5×105個·mL-1,接種于24孔板中,加入100μL 不同質量濃度的蛇毒樣 品使得蛇毒終質量濃度分別為3.125,6.25,12.5,25,50,100和200μg·mL-1,空白對照(蛇毒質量濃度為0)加 入等量的PBS,輕輕搖勻,置于培養箱中孵育12h;再用PBS清洗兩次,于顯微鏡下拍照,并隨機選擇3個視野進 行計數(放大倍率為10×20倍),以粘附率來表示 A2780細胞的粘附能力:其中:R 為粘附率;Q1 和Q0 分別為蛇毒處理后的培養細胞數量和空白對照的培養細胞數量。

    1.3.6 數據統計

    本研究所得數據均用x珚±s表示,采用SPSS18.0軟件對細胞增殖活力、粘附率等數據進行單 因素方差分析,當p<0.05時,分析結果具有統計學意義。

    2結果與分析

    不同質量濃度的尖吻蝮蛇毒作用于 A2780細胞12h后,在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態。結果顯示:空 白對照 A2780細胞貼壁良好,輪廓清晰,分布均勻,呈規則形態;當蛇毒質量濃度為3.125μg·mL-1時, A2780細胞皺縮、變圓,出現少量凋亡的現象;隨著蛇毒質量濃度的增加,大量 A2780細胞皺縮、變圓、黏 連成團,出現明顯的凋亡現象。以上結果說明尖吻蝮蛇毒可誘導 A2780細胞凋亡,且兩者呈劑量依賴 關系,即:蛇毒劑量越大,細胞凋亡現象越明顯。為探究不同時間條件下尖吻蝮蛇毒對 A2780細胞的形態學影響,選用50μg·mL-1的蛇毒作用于 A2780 細胞,結果如圖2所示:未加蛇毒時,A2780細胞貼壁良好,輪廓清晰,分布均勻,呈規則形態;當蛇毒處理 A2780細胞1h時,少量被處理細胞出現皺縮、變圓的現象;當蛇毒處理 A2780細胞6h時,大量被處理 細胞皺縮、變圓的現象;當蛇毒處理 A2780細胞12h時,被處理細胞粘連成團并大量出現凋亡現象。以 上結果說明尖吻蝮蛇毒誘導 A2780細胞凋亡的時間越長,細胞凋亡現象越明顯。

    3討論

    腫瘤細胞主要特征是無限增殖、侵襲和轉移。腫瘤細胞侵襲和轉移機制復雜,涉及許多調控因子、細胞因子 等之間的相互作用———這是導致腫瘤惡性發展的主要原因。細胞之間粘附能力的變化是細胞轉移的初始階段, 并有助于腫瘤細 胞 從 原 發 部 位 脫 落,侵潤周圍的組織,啟 動 轉 移 程 序。本 研 究 中,經尖吻蝮蛇毒處理的 A2780細胞形態發生了明顯變化:細胞變小、變圓、皺縮,且蛇毒質量濃度及時間與 A2780細胞的形態變化呈劑 量依賴關系。A2780細胞形態的變化可能是由于尖吻蝮蛇毒破壞了細胞結構,從而影響了維持細胞正常形態的 功能。當尖吻蝮蛇毒的質量濃度為25μg·mL-1時,A2780細胞活力低于50%,顯示蛇毒對該細胞具有明顯 的抑制細胞增殖作用。蛇毒抑制癌細胞增殖主要通過兩個途徑:一是上調抑癌基因表達與下調促癌基因表達, 二是阻滯細胞周期。但尖吻蝮蛇毒抑制 A2780細胞增殖的具體途徑還有待進一步的研究。在本研究中,當 尖吻蝮蛇毒質量濃度高于6.25μg·mL-1時,A2780細胞粘附率銳減,其中原因有可能是蛇毒引起受處理細胞 的緊密連接蛋白表達異常,從而導致細胞連接完整性被破壞,繼而使細胞之間粘附能力。然而,尖吻蝮蛇 毒影響 A2780細胞粘附的分子機制也有待進一步探究。

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